Перекисное окисление липидов мембраны нейрона. Перекисное окисление липидов (ПОЛ)

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

ГОМЕЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

Медико-диагностический факультет

Кафедра клинической лабораторной диагностики

Лабораторная диагностика интенсивности перекисного окисления липидов

Курсовая работа

Исполнитель: Подстреха Елена Станиславовна

студентка группы Д-503

Научный руководитель: заведующая кафедрой, доктор медицинских наук, доцент Новикова Ирина Александровна

ГОМЕЛЬ 2016г

Реферат

В работе проведен анализ литературы об исследовании ферментативных и неферментативных путях образования активных форм кислорода, механизмы их повреждающего воздействия на живые клетки, в частности инициация свободнорадикального перекисного окисления липидов. Рассмотрены анти- и прооксидантные системы защиты организма, осуществляющие баланс между возникновением, метаболизмом и утилизацией активных форм кислорода.

Курсовая работа 35 страниц, 1 таблица, 17 источников.

Перечень ключевых слов: перекисное окисление липидов, свободно - радикальное окисление, активные формы кислорода, антиоксидантная защита, малоновый диальдегид.

Перечень сокращений

Введение

Роль свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы в организме человека

1 Формы свободных радикалов в организме

2 Общая характеристика основных АФК, их биологическая роль

3 Физиологическая роль свободнорадикального окисления

4 Регуляция свободно-радикального окисления

5 Система антиоксидантной защиты организма

6 Патогенетические механизмы нарушений, развивающиеся при нарушении баланса антиоксидантной и прооксидантной систем

Свободнорадикальное (перекисное) окисление липидов

1 Участие АФК и продуктов ПОЛ в патогенезе заболеваний человека

2 Диагностика процессов перекисного окисления

Заключение

Перечень условных обозначений

АОА - антиоксидантная активность

АО - антиоксидант

АФК - активные формы кислорода

ГР - глутатионредуктаза

ГП - глутатионпероксидаза

МП - миелопероксидаза

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СОД - супероксиддисмутаза

СРО - свободно-радикальное окисление

ХЛ - хемилюминесценция

ЭПР - электронный парамагнитный резонанс

Введение

перекисный окисление липид активный кислород

В организме в результате окислительно-восстановительных реакций постоянно происходит генерация активных форм кислорода (АФК), которые обладают высокой реакционной способностью, вызывая, в частности, окислительную модификацию биополимеров: белков, липидов, нуклеиновых кислот, углеводов. Радикалы кислорода, несмотря на свою реакционность и потенциальную токсичность, в малых концентрациях являются нормальными метаболитами множества биохимических реакций в клетке. В физиологических условиях свободно-радикальные реакции протекают на низком уровне. Процессы, протекающие с участием радикалов кислорода, свидетельствует о важной роли этих соединений в поддержании гомеостаза, формировании резистентности организма против инфекций, обеспечении регенерации тканей и органов. Если процесс генерации АФК усиливается, это может явиться и является пусковым фактором развития целого перечня разнообразных патологических процессов.

Актуальность углубленной разработки проблемы патогенетической значимости свободнорадикального перекисного окисления обуславливается нарастающим экологическим неблагополучием. Изучение этого важного звена гомеостаза имеет непосредственное прикладное значение, т. к. позволяет разрабатывать и применять адекватные профилактические подходы, предупреждающие запуск цепной реакции свободнорадикального окисления или нейтрализующие токсичность продуктов ПОЛ.

1. Роль свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы в организме человека

Системы, участвующие в образовании АФК, и процессы, связанные с окислительной альтерацией биологических соединений, условно объединены понятием прооксидантная система.

К прооксидантам в живой клетке относятся высокие концентрации кислорода (например, при длительной гипербарической оксигенации больного), ферментные системы, генерирующие супероксидные радикалы (например, ксантиноксидаза, ферменты плазматической мембраны фагоцитов и др.), ионы двухвалентного железа.

Окислительные реакции - основа энергообразования и жизнедеятельности всех клеток организма человека. Они могут протекать без присоединения кислорода (оксидазные реакции) и с присоединением молекулярного или атомарного кислорода - оксигеназные реакции. Промежуточными продуктами последних является перекиси и эпоксиды, поэтому такие реакции называются перекисным окислением. Оно индуцируется высокореактивными свободными радикалами.

В физиологических условиях интенсивность перекисных процессов незначительна и поддерживается на стационарном уровне благодаря многокомпонентной системе нейтрализации постоянно образующихся свободных радикалов - антиоксидантной системе.

Образование прооксидантов в тканях уравновешивается активностью внутри- и внеклеточных антиоксидантов, формируя определенный оптимальный уровень прооксидантно-антиоксидантного равновесия .

1.1 Формы свободных радикалов в организме

Известно множество окислительно-восстановительных реакций, в ходе которых образуются различные виды свободных радикалов. Свободные радикалы были открыты в конце прошлого столетия. К настоящему времени их описано более 8000. Свободные радикалы являются высокоактивными соединениями, которые образуются в физиологических условиях как вторичные продукты в процессе метаболизма, а также другими путями, включая редокс-реакции, осуществляемые путем одноэлектронного переноса; гомолиз инициаторных молекул, обладающих слабой ковалентной связью, радиолиз; фотолиз, термолиз.

Многие ксенобиотики, включая различные лекарственные препараты, алкоголь и др., метаболизируются в организме, генерируя свободные радикалы. Несмотря на большое разнообразие их происхождения и структуры, свободные радикалы подразделяются на 3 большие группы: 1) радикалы реактивного кислорода (ROS); 2) радикалы реактивного азота (RNS); 3) радикалы реактивного хлора (RCS) .

Свободный радикал - это молекула, атом или группа атомов, имеющих неспаренный электрон на внешней атомной орбитали. АФК являются активными участниками большого числа химических реакций в клетках, оказывая разнообразное физиологическое действие .

Отличительные особенности свободных радикалов:

наличие неспаренного электрона на внешнем энергетическом уровне;

собственный магнитный момент;

высокая химическая активность и малое время жизни;

способность инициировать цепные реакции окисления;

Наиболее вероятно появление свободных радикалов в организме при последовательном присоединении электронов к кислороду и во время свободнорадикального перекисного окисления липидов.

Основные процессы, ведущие к образованию свободных радикалов в организме:

последовательное присоединение электронов к кислороду в присутствии металлов переменной валентности;

микросомальное и митохондриальное окисление, фагоцитоз;

ферментативные реакции с участием гидролаз, оксидаз, дегидрогеназ;

реакции автоокисления и биосинтеза (тиолы, катехоламины и т. д.);

окисление чужеродных соединений - ксенибиотиков, некоторых лекарственных препаратов;

действие негативных факторов среды (физические и химические инициаторы окисления);

фотохимические процессы;

перекисное окисление липидов.

модификация физико-химических свойств биологических мембран;

защитные функции, окисление чужеродных соединений, микробицидное действие;

обмен веществ, аккумуляция и биотрансформация энергии;

влияние на иммунитет, передачу информации.

Наиболее распространенные в организме формы свободных радикалов:

Активные формы кислорода:

О˙2 - супероксидный анион радикал;

¹O2 - синглетная форма кислорода;

OH˙ - гидроксильный радикал;

Н2О2 - перекись водорода;

Окисленные галогены: CLO˙ - гипохлорид, хлорамины;

Окислы азота: NO˙ - оксид азота;

Свободные радикалы образующиеся при перекисном окислении липидов: RO˙, RO2˙- моно-, димерные, полимерные, циклические, алкоксильные и перекисные радикалы жирных кислот.

2 Общая характеристика основных АФК, их биологическая роль

Радикалы кислорода образуются в ходе процессов, связанных с транспортом электронов по дыхательной цепи. В обычных условиях на генерацию АФК расходуется от 1 до 5 % потребляемого кислорода. Однако эта величина может существенно возрастать при изменении кислородного бюджета организма - при гипероксии или гипоксии. В результате последовательного восстановления молекулярного кислорода происходит образование супероксидного аниона, перекиси водорода, гидроксильного радикала.

Супероксиданион-радикал (О˙2) образуется при присоединении одного электрона к молекуле кислорода в основном состоянии. Радикал является относительно слабым окислителем и во многих биологических системах выступает в качестве донора электронов, восстанавливая ряд соединений. При взаимодействии с протоном О2 переходит в гидроперекисный радикал. Кроме этого, именно он является потенциальным источником гидроксильного радикала и перекиси водорода.

Супероксиданион-радикал - более реакционноспособное соединение, чем кислород. В организме супероксиданион-радикал представляет собой промежуточный продукт многих биохимических реакций, таких как окисление тиолов, флавинов, хинонов, катехоламинов, птеринов, а также метаболизма ксенобиотиков. Из источников супероксиданион-радикала наибольший интерес представляют гемоглобин, миоглобин, восстановленный цитохром С, НАДФН-оксидазы фагоцитирующих клеток и др. Основным источником радикала в крови являются нейтрофилы, генерирующие его при ряде реакций специфического и неспецифического иммунитета. Еще один фермент, специализированный на образовании супероксиданион-радикала - это ксантиноксидаза, которая в нормальных условиях находится преимущественно в дегидрогеназной форме и может обратимо и необратимо переходить в оксидазную форму, что происходит при ишемии. Считается, что генерация радикала ксантиноксидазой необходима для метаболизма железа, регуляции тонуса сосудов и клеточной пролиферации, обеспечения микробицидного потенциала нейтрофилов.

Супероксиданион-радикал - пусковое звено каскада свободно-радикальных реакций, приводящих к возникновению большинства АФК и продуктов ПОЛ. Он участвует в синтезе хемотаксических пептидов, усиливает митогенстимулированную пролиферацию лимфоцитов, ингибирует действие эндотелиального фактора расслабления, может повреждать мембраны эритроцитов, ингибировать Са2+-АТФ-азу, синтез РНК и белка эндотелиальных клеток, окислять белки сыворотки, в то же время его непосредственная цитотоксичность невелика.

Для регуляции уровня О˙2 в клетках служит высокоспецифичный фермент антиоксидант - супероксиддисмутаза, которая обладает способностью существенно ускорять реакции дисмутации радикала в перекись водорода.

Перекись водорода (Н2О2). Присоединение двух электронов к молекуле кислорода или одного электрона к аниону О2 сопровождается образованием двухзарядного аниона О22ˉ, который переходит в НО2˙ или перекись водорода. Перекись водорода относят к окислителям средней силы; в отсутствие ферментных антиоксидантов и ионов металлов переменной валентности она относительно стабильна и может мигрировать в клетки и ткани. Перекись водорода оказывает ограниченное повреждающее действие, вызывая, в частности, нарушение гомеостаза кальция в клетке. В организме ее источниками являются реакции с участием оксидаз (ксантиноксидазой, оксидазой L-аминокислот и рядом других), переносящими два электрона на молекулу кислорода, а также реакция дисмутации супероксиданион-радикала, катализируемая супероксиддисмутазой. Эта реакция является источником почти 80 % перекиси водорода в очаге воспаления.

Перекись водорода является промежуточным продуктом при образовании большинства АФК. Н2О2 - один из источников возникновения наиболее токсичного из АФК - гидроксильного радикала. В присутствии миелопероксидазы из нее происходит образование высокореакционных гипогалоидов - НОС1, HOBr, HOJ, HOSCN.

В обычных условиях клетки млекопитающих достаточно устойчивы к воздействию перекиси водорода благодаря наличию ферментов - глутатионпероксидазы и каталазы. Молекулы Н2О2 выполняют ряд регуляторных функций в клетке. Перекись может служить в качестве метаболического сигнала для индукции экспрессии генов, осуществляющих синтез структурных и функциональных белков в клетке.

Гидроксилъный радикал (НО˙) является наиболее реакционноспособным и, соответственно, токсичным из всех АФК, образующихся в биологических системах. Радикал может разрывать любую углеводородную связь, при этом скорость его взаимодействия с органическими субстратами достигает величин, равных скорости диффузии (т. е. 107-1010 моль/с, что в 106 раз выше, чем для супероксиданион-радикала и перекиси водорода). По сравнению с другими АФК, НО˙ обладает наиболее высоким редокс-потенциалом, равным + 2,7, что позволяет ему атаковать и разрушать любые макромолекулы практически на месте в момент появления.

Основным источником гидроксильного радикала является реакция Фентона с участием металлов переменной валентности, главным образом, с Fe2+, по схеме Н2О2 + Fe+2 → Fe+3 + ОН + ОН˙. Образование радикала также происходит в ходе окисления арахидоновой кислоты, в реакции Габер-Вейса, Осипова, при микросомальном окислении, в реакциях с флавиновыми ферментами и CoQ. Обратное восстановление Fe3+ возможно в реакции с О2, а также при взаимодействии с аскорбиновой кислотой, глутатионом, цистеином и другими окисляющими соединениями. Показано, что цитотоксическое и канцерогенное действие ионизирующих излучений напрямую связано с образованием гидроксильного радикала в процессе радиолиза воды. НО˙ также участвует в реализации микробицидного и цитотоксического действия гранулоцитов, моноцитов и Т-лимфоцитов. Гидроксильные радикалы вызывают повреждения нуклеиновых кислот, белков, а также других клеточных структур, ингибируют ряд фракций комплемента. Они индуцируют образование органических радикалов и таким образом запускают процессы ПОЛ. Ввиду высокой неспецифичности реакций радикала с разными органическими молекулами, его взаимодействие носит цепной характер. Важно отметить, что в организме нет специализированных ферментных систем, обладающих способностью инактивировать гидроксильный радикал. Низкомолекулярные соединения, такие как урацил, мочевая кислота, салицилаты, глюкоза, диметилсульфоксид, обладают способностью ингибировать ОН˙ радикал только при достаточно высоких концентрациях. Таким образом, при целом ряде патологических состояний, сопровождающихся избыточным образованием АФК и, соответсвенно, гидроксильного радикала, организм становится практически беззащитным перед повреждающим действием этого соединения. Предотвращение повреждений клеточных структур осуществляется только за счет снижения концентрации радикалов - предшественников ОН, в частности, супероксиданион-радикала и перекиси водорода. Способностью разрушать эти радикалы-предшественники обладают СОД и каталаза.

Синглетный кислород(¹O2). Образуется при изменении спина одного из электронов р-орбитали в молекуле кислорода. Возникновение ¹O2 как сопутствующего продукта отмечено во многих ферментативных реакциях с участием СОД, каталазы и пероксидаз, а также в реакциях с участием большинства АФК. Так, в реакции разложения перекиси водорода каталазой до 1%, образующегося кислорода возникает в синглетном состоянии. Синглетный кислород обладает высокой реакционной способностью и легко вступает в окислительные реакции с органическими соединениями. Он часто выступает в качестве индуктора реакций ПОЛ. Хотя ¹О2 обладает цитотоксическим действием и принимает участие в реализации микробиоцидного действия гранулоцитов, его вклад в эти процессы не является определяющим. Одним из наиболее эффективных гасителей синглетного кислорода в клетке является бета-каротин, одна молекула которого способна потушить около 1000 его молекул прежде, чем подвергнется окислительной деструкции .

АФК выступают в качестве вторичных посредников в процессах жизнедеятельности клеток. Включаясь в сигнальную трансдукцию, АФК влияет на ключевые звенья метаболических процессов: фосфорилирование, метаболизм Са2+, модуляция факторов транскрипции, гидролиз фосфолипидов. При любых стрессорных реакциях организма, сопровождающихся состоянием окислительного стресса, АФК участвуют в передаче сигнала от первичных посредников для запуска каскада реакций, необходимых для приспособления и выживания в экстремальных условиях.

Каждая ткань обладает определенной буферной ёмкостью АОЗ. Она зависит от состояния АОЗ межклеточной жидкости и самой клетки, отдельных её компонентов. Некоторые ткани в силу особенностей своей функциональной и метаболической активности обладают высокой чувствительностью к состоянию окислительного стресса, это связано с высокой потенциальной мощностью прооксидантной системы и низкой буферной емкостью АОЗ. К таким тканям относятся мозг, сетчатка, легкие. Это обусловлено важной регуляторной функцией, которую выполняют генерируемые АФК и радикальные метаболиты в этих тканях. В мозговой ткани это связано с передачей сигналов возбуждения, возникновения потенциала действия и включения в работу синапсов.

АФК - вторичные мессенджеры.

Метаболический фон любой клетки зависит от характера информации, поступающей из окружающей среды. Носителями этой информации являются первичные мессенджеры: гормоны, цитокины, нейротрасмиттеры. Этот процесс осуществляется за счет клеточной сигнализации или сигнальной трансдукции. А в передачу сигнала через клеточную мембрану включаются вторичные мессенджеры. В качестве вторичных посредников принимают активное участие АФК. Они осуществляют регулирующую роль в процессах роста клеток, апоптозе, клеточной адгезии, свертывания крови и т. д. Низкие (микромолярные) концентрации АФК увеличивают рост или усиливают ответ на стимуляцию роста во многих типах клеток, а антиоксиданты подавляют нормальную клеточную пролиферацию. Низкие концентрации Н2О2 стимулируют рост фибробластов. Ингибирование СОД или глутатионпероксидазы увеличивает клеточную пролиферацию. ОН˙, являться фактором, усиливающим клеточную пролиферацию и активность митоген-активируемой протеинкиназы (МАР-киназа).

В физиологических концентрациях АФК в роли вторичных посредников образуется опосредованно через лиганд-рецепторное взаимодействие. В качестве таких лигандов могут выступать гормоны (инсулин, ангиотензин, паратиреоидный гормон, витамин Дз), цитокины, факторы роста. Образование лиганд-рецепторных комплексов сопровождается образованием АФК, которые активно включаются в сигнальную трансдукцию, влияя на ключевые звенья метаболических процессов в клетке.

Первичные мессенджеры осуществляют регуляцию уровня АФК в клетке за счет активации процессов их генерации с одной стороны и снижения активности отдельных звеньев АОЗ с другой. В этом процессе активное участие принимают цитокины. Цитокины стимулируют освобождение АФК из многих типов клеток, включая фибробласты человека, эпителиальные и эндотелиальные клетки. С АФК связана передача сигнала от тромбоцитарного фактора роста, эпидермального фактора роста, трансформирующего фактора роста β-1, фактора некроза опухолей. Участие интерлейкина-1 и интерферона в сигнальной трансдукции связывают с образованием О2ˉ, а ФНО - с Н2О2.

АФК выполняют роль вторичных мессенджеров и в клетках костной ткани. ФНО, интерлейкин-1, паратиреоидный гормон и витамин Д стимулируют образование АФК за счет присутствующей в

остеокластах НАДФН-оксидазы. Вазоактивный пептид (ангиотензин II) проявляет свое действие на процессы мышечного сокращения и клеточный рост гладких мышц сосудов через генерацию внутриклеточного О˙2ˉ. Источником О˙2ˉ являлись НАДН и НАДФН-оксидазы, так как оба фермента активируются ангиотензином.

АФК в качестве вторичных мессенджеров участвует регуляции обмена Са2+, стимуляции фосфолирирования белков и активации факторов транскрипции.

В присутствии оксидантов увеличивается транспорт Са2+ через кальциевые-каналы и ингибируется АТФ-зависимый Са2+-насос.

Оксиданты, увеличивая активность различных

протеинкиназ, участвуют в регуляции многочисленных клеточных процессов, таких как митогенез, клеточная адгезия, апоптоз и т.д.

Также звеном действия оксидантов в качестве вторичных мессенджеров является фосфолипаза А2. Её активация оксидантами сопряжена с вовлечением многих путей передачи сигнала. Арахидоновая кислота, как продукт фосфолипазы А2 , является важным медиатором таких процессов как воспаление, иммунные процессы, НАДФН-оксидазная активность, свертывание крови.

Таким образом выделяют 3 возможных пути действия оксидантов в качестве вторичных мессенджеров на процессы в клетке, связанные с образованием сигнальных молекул:

Влияние на структуру клеточных мембран.

Влияние на состояние депо Са2+, что сопровождается его мобилизацией из депо и поступлением в цитозоль.

Активация фосфолипазы А2 .

1.3 Физиологическая роль свободнорадикального окисления

Любой радикал является индуктором свободнорадикальных реакций. Процессы свободнорадикального окисления (СРО) с участием АФК при достаточно низкой интенсивности относятся к нормальным метаболическим процессам. Радикалы кислорода индуцируют процессы ПОЛ, необходимые для процессов обновления фосфолипидов и регуляции проницаемости клеточных мембран. Важной физиологической функцией АФК является активация ряда мембранных белков и иммуноглобулинов, а также ферментов, регулирующих переключение метаболических путей и синтез макроэргических соединений в клетке. С процессами СРО непосредственно связаны окислительное фосфорилирование и скорость клеточного деления. Перекись водорода может выступать в качестве метаболического сигнала для внутриклеточных процессов, приводящих к окислению специфических SH-групп протеинкиназ. Будучи активированными, эти белки транслоцируются в ядро и индуцируют экспрессию групп генов, продукты экспрессии которых ответственны за различные формы защитных реакций клетки. Кроме этого, перекись обладает инсулиноподобным действием.

Продукты свободно-радикальных реакций и ПОЛ участвуют в биосинтезе прогестерона, стероидных и тиреоидных гормонов, лейкотриенов, тромбоксана А2, протромбина. Важным свойством активных метаболитов кислорода и, в частности, супероксиданион-радикала, является регуляция метаболизма соединительной ткани. АФК стимулируют пролиферацию фибробластов, синтез и распад коллагена и триптофана, участвуют в метаболизме железа. Некоторые из оксигеназ, а именно группа ферментов, получивших наименование цитохрома Р-450 (в настоящее время насчитывается более сотни изоформ), помимо гидроксилирования эндогенных соединений, используют кислород и ряд АФК для детоксикации липофильных ксенобиотиков. Цитохром Р-450 зависимые монооксигеназы и сопряженная с ними электронно-транспортная система осуществляют внедрение АФК непосредственно в молекулу субстрата, что приводит к образованию окисленного, более гидрофильного продукта. В организме цитохром Р-450-зависимые монооксигеназы выполняют ряд важнейших функций. Во-первых, это окислительная биотрансформация (биосинтез или деградация) эндогенных липофильных молекул-эндобиотиков (стероидов, ретиноидов, метаболитов арахидоновой кислоты), во-вторых, биотрансформация поступающих извне химических соединений-ксенобиотиков, которые не являются участниками нормальных биохимических процессов в клетке и подлежат удалению. Основная монооксигеназная реакция всегда сопровождается образованием супероксиданион-радикала, перекиси водорода, а иногда и активных метаболитов окисляемого субстрата. Преимущественно эти ферменты представлены в эндоплазматическом ретикулуме клеток, максимально ферментная система экспрессирована в гепатоцитах, надпочечниках и половых железах .

АФК участвуют в регуляции сосудистого тонуса путем ингибирования эндогенного оксида азота. Одна из радикальных форм кислорода - пероксинитрил, легко превращающаяся в исходные продукты - оксид азота и супероксиданион-радикал, является транспортной формой для N0˙, в результате чего радиус действия этой сигнальной молекулы может значительно увеличиваться. Свободнорадикальная природа пероксинитрила является причиной ослабления и нивелирования многочисленных физиологических эффектов оксида азота. Взаимодействие же закиси азота и супероксиданион-радикала сопровождается резким усилением окислительного потенциала последнего.

Метаболиты кислорода участвуют в рекциях клеточного и гуморального иммунитета как регуляторы и эффекторы этих процессов. В частности, радикалы кислорода, генерируемые оксидазами нейтрофильных гранулоцитов и мононуклеарных фагоцитов, играют одну из основных ролей в реализации микробицидного, цитотоксического и иммунорегуляторного действия этих клеток. При этом основными эффекторами микробицидного действия являются гидроксильный радикал, перекись водорода и гипогалоиды.

АФК стимулируют пролиферацию иммунокомпетентных клеток. Доказано прямое участие супероксиданион-радикала в образовании хемотаксических факторов, вызывающих активацию и миграцию лейкоцитов в очаг воспаления. Способностью вызывать синтез хемотаксических пептидов обладает и гидроксильный радикал, который одновременно с этим усиливает митогенстимулированную пролиферацию и последующую дифференцировку лимфоцитов.

Многие важные процессы, такие как генерация конечных продуктов пуринового обмена и распад дофамина, сопровождаются выработкой АФК.

Адренэргическая стимуляция физиологически приводит к усилению, а холинэргическая - к ослаблению продукции эндогенных АФК, противоположно изменяет редокс-потенциал клетки и создает условия для пермессивного эффекта, когда один и тоже сигнал вызывает различный ответ клеток, в зависимости от их редокс-состояния. Так, например, ФНО вызывает либо гибель клеток, либо их пролиферацию, т.к. зависимый от него фактор транскрипции срабатывает только при сдвиге окислительного потенциала клеток - мишеней.

Осуществляя защитные реакции, клетки (макрофаги и гистиоциты) могут многократно усиливать продукцию АФК. При фагоцитозе происходит ″метаболический взрыв″ в фагоцитах, т.е. многократное усиление потребления энергии фагоцитирующей клеткой. Значительная часть этой энергии расходуется НАДФН - зависимыми оксидазами на образование супероксидного радикала.

АФК осуществляют бактерицидный эффект в фаголизосомах, т.к. в отличие от лизосомальных гидролаз, АФК способны разрушать неповрежденные клеточные стенки бактерий и интактные мембраны клеток, кислородзависимый механизм завершающей стадии фагоцитоза более важен чем гидролитический.

АФК также секретируется вовне в процессе экзацитоза, в расчете на их способность разрушать причинный агент первичной альтерации, путем перекисного окисления мембран соседних клеток, осуществляют вторичное самоповреждение и способствуют выработке эйкозанойдных медиаторов воспаления .

1.4 Регуляция свободно-радикального окисления

Скорость СРО и содержание свободных радикалов в организме в норме поддерживается на определенном уровне сложной, многоступенчатой системой регуляции. В ней можно условно выделить специфические и неспецифические факторы, значение и вклад которых меняется на различных стадиях окисления.

Неспецифические факторы:

механизмы, регулирующие количество и качество субстрата окисления и его доступность;

факторы, влияющие на инициаторы окисления, в частности, на состояние металлов переменной валентности;

физико-химические свойства биологических мембран;

механизмы, поддерживающие низкое содержание O2 в тканях.

Специфические механизмы:

ферменты, ответственные за образование и метаболизм АФК (СОД, каталаза и др.);

системы, утилизирующие перекисные продукты (глутатион-пероксидаза, глутатион-редуктаза и др.);

перехватчики АФК (метионин, гистамин и др.);

биоантиоксиданты (токоферол, убихинон, церулоплазмин).

1.5 Система антиоксидантной защиты организма

Исходя из свойств радикальных производных молекулярного кислорода и органических перекисей, защита организма от их пагубного воздействия является одной из важнейших задач по поддержанию гомеостаза. Систему защиты тканей и клеток от токсических метаболитов кислорода и продуктов ПОЛ можно условно разделить на физиологическую (механизмы, осуществляющие регуляцию доставки и поступления кислорода к клеткам) и биохимическую (собственно антиоксидантную систему организма, т. е. широкий класс химических соединений, снижающих активность радикальных окислительных процессов). Физиологический компонент системы АО защиты организма обеспечивает равновесие между интенсивностью транспорта кислорода к клеткам и метаболическими процессами по его выгодной и безопасной утилизации. Эти механизмы ограничения свободнорадикальных реакций обеспечиваются за счет:

наличия каскада уровней парциального давления кислорода, понижающегося от альвеол к клеткам с 100-105 до 8-10 мм.рт. ст., то есть в 10-13 раз.

снижения напряжения кислорода в некоторых субклеточных структурах в 100-1000 раз по сравнению с парциальным давлением кислорода в капиллярах. Процесс опосредован относительно большой межкапиллярной дистанцией и высоким сродством цитохромоксидазы к кислороду;

редукции микроциркуляции в тканях при увеличении парциального давления кислорода в артериальной крови. Происходящий при этом так называемый «гипероксический вазоспазм» имеет несколько причин. Существенное значение придается снятию сосудорасширяющего действия СО, а также снижению активности NO-синтаз и, соответственно, снижении выработки основного фактора расширения сосудов - оксида азота. Признается также и возможность прямого сосудосуживающего действия кислорода .

Биохимическую АО-систему организма условно можно разделить на специфическую и неспецифическую. Специфическая АО-система направлена на разрушение АФК и продуктов их дальнейших превращений. Действие неспецифической АО-системы связано с предотвращением условий и возможностей утечки электронов и генерации АФК в ходе окислительно-восстановительных реакций (в рамках окислительного фосфорилирования) или в процессе аутоокисления субстратов (микросомальное окисление).

Патогенному воздействию ПОЛ противостоят специализированные ферментные системы и целый ряд неферментных соединений. К специфическим АО-энзимам можно отнести супероксиддисмутазу, каталазу, глутатионзависимые пероксидазы и трансферазы. Эта группа ферментов локализующихся преимущественно внутриклеточно, обладает способностью разрушать свободные радикалы, а также участвовать в разложении гидроперекисей нерадикальным путем. Энзимы антирадикальной защиты характеризуются высокой избирательностью действия, направленного против определенных радикалов; специфичностью клеточной и органной локализации, а также использованием в качестве стабилизаторов металлов, к которым относятся медь, цинк, марганец, железо и ряд других.

ОксидантыАнтиоксидантыАктивные формы кислорода: О˙2 - супероксидный анион радикал; ¹O2 - синглетная форма кислорода; OH˙ - гидроксильный радикал; Н2О2 - перекись водорода; Окисленные галогены: CLO˙ - гипохлорид, хлорамины; Окислы азота: NO˙ - оксид азота; Свободные радикалы образующиеся при перекисном окислении липидов: RO˙, RO2˙- моно-, димерные, полимерные, циклические, алкоксильные и перекисные радикалы жирных кислот[.Ферментные Супероксиддисмутазы Каталаза Глутатион (GSH-)-пероксидазы GSSG-редуктазы Глутатион- S-трансферазы УДФ-глюкуронилтрансферазы НАДФ- Н-хиноноксидоредуктаза НАДФ- Н-хиноноксидоредуктаза Неферментные Глутатион а-Токоферол (витамин Е) β-Каротин Ураты Билирубин Флавоноиды Альбумин Церулоплазмин ТрансферринТаблица 1.Сводная таблица оксидантов и антиоксидантов.

Содержание АО-ферментов в различных тканях организма существенно различается. Так, их уровень и активность в клетках соединительной ткани в несколько раз ниже, чем в паренхиматозных органах. Уровень ферментативных АО в клетках находится под генетическим контролем. Так, повышение содержания супероксиданион-радикала или перекиси водорода в цитозоле клеток сопровождается активацией транскрипции генов, запускающих синтез около 40 белков, среди которых - каталаза, супероксиддисмутаза, гидропероксидаза, а также эндонуклеаза репарации ДНК. Практически все воздействия, приводящие к усилению образования АФК в клетках, индуцируют синтез ферментативных АО.

В условиях гипоксии и гипероксии, т. е. состояний, усиливающих образование АФК, повышается уровень ферментных АО внутри клеток. В нормальных условиях содержание ферментных АО относительно постоянно и мало зависит от пола, отмечается некоторое снижение их уровня с возрастом. В то же время нормальное функционирование АО-системы организма и содержание ферментных АО резко нарушается при критических состояниях (ранениях, травмах, а также обширных ожогах кожи. Тяжелые травмы сопровождаются нарушением динамического равновесия прооксидантных и антиоксидантных систем, при этом содержание и активность эндогенных антиоксидантов, в том числе и АО-энзимов, резко снижается внутри и вне клеток .

Как уже отмечалось, ключевым ферментом АО-защиты является супероксиддисмутаза (СОД), открытая McCord J. и Fridovich I. в 1969 г. СОД относится к классу окислительно-восстановительных ферментов и присутствует в значительных количествах практически во всех про- и эукариотических клетках. В организме человека СОД обнаружена во всех органах и тканях, причем особенно высока внутриклеточная концентрация.

В крови фермент находится в следовых концентрациях, при экзогенном введении чрезвычайно быстро, в течение 5-10 минут выводится в неизмененном виде почками. Высокая концентрации СОД, сравнимая с внутриклеточной, отмечается в бронхоальвеолярной жидкости. Во внеклеточном пространстве фермент присутствует в очень малых количествах. Следствием этого в случае образования большого количества супероксиданион-радикалов во внеклеточном пространстве, например, в очаге воспаления, организм оказывается практически беззащитным перед повреждающим воздействием радикалов.

Основной функцией СОД является ускорение реакции дисмутации супероксидных радикалов, образующихся в ходе биологического окисления. Скорость спонтанной реакции при нейтральных значениях рН не превышает 7 х 105 Мˉ1 сˉ1, в присутствии СОД она возрастает до 2 х 109 Мˉ1 сˉ1 и выше, т. е. фермент ускоряет реакцию на три-четыре порядка.

СОД имеет несколько изоформ, различающихся строением активного центра. Железосодержащий изофермент характерен только для микроорганизмов, для клеток человека характерны две его другие разновидности. Марганецсодержащий фермент (Mn-СОД) локализован в митохондриях, цианидрезистентен. В общем объеме супероксиддисмутазной активности доля Mn-СОД невелика и составляет около 15%. До 40% СОД, сконцентрированной в ядрах клеток, приходится именно на марганцевую форму фермента, которая дисмутирует до 20% супероксидных радикалов, продуцирующихся в ядре клетки. Медь-цинковая форма энзима (Си, Zn-СОД), чувствительная к цианиду, содержится в цитозоле и межмембранном пространстве митохондрий. Считается, что атом меди обеспечивает каталитическую активность, а атом цинка - стабилизацию структуры цитозольной изоформы фермента. Низкомолекулярые тиолы за счет восстановления иона Си2+, присутствующего в активном центре СОД, активируют энзим и ускоряют дисмутацию кислорода.

В большинстве случаев фермент состоит из двух одинаковых субъединиц (молекулярный вес колеблется в пределах 30-40 кДа), каждая из которых содержит каталитически активный ион меди и ион цинка, связанные общим лигандом - имидазолом гистидина 61.

Важнейшая роль СОД для клеточного метаболизма предопределена не только широким распространением этого фермента, но и рядом его уникальных свойств: высокой термоустойчивостью, устойчивостью к действию протеаз, денатурирующих агентов, широким оптимумом рН каталитической активности. Фермент довольно устойчив в растворах - выдерживает нагревание до 100° С в течение минуты, не теряет активности в диапазоне рН от 2 до 12.

Каталаза представляет собой гемсодержащий фермент с молекулярной массой 250 кДа. Также как и СОД, каталаза представлена во всех клетках организма, однако ее уровень в различных тканях неодинаков. Высокое содержание каталазы обнаружено в эритроцитах, почках и печени. В пероксисомах последних фермент составляет до 40 % всего белка. Реакция, катализируемая каталазой, в общем виде выглядит следующим образом.

Скорость катализа исключительно велика: одна молекула каталазы в секунду разлагает до 44 000 молекул перекиси водорода. Активность каталазы зависит от соотношения числа дисульфидных связей к количеству сульфгидрильных групп в молекуле фермента, которые участвуют в образовании ее активного центра. Из-за этого каталаза чувствительна к действию тиоловых ядов. Из-за большого молекулярного веса молекулы энзим практически не проникает через клеточные мембраны. Это является некоторым препятствием для использования препаратов каталазы в практике.

АО-ферменты СОД и каталаза, функционируя совместно, своевременно инактивируют АФК, супероксиданион-радикал и перекись водорода, образующихся в процессе нормального метаболизма клеток, а также при значительной интенсификации процессов ПОЛ. Однако данные ферменты обладают слабой активностью по отношению к липидным пероксидам, образующимся в ходе цепных реакций ПОЛ. Разрушение этих продуктов осуществляется с участием ферментной системы глутатиона.

Система ферментов глутатиона. Селенсодержащая глутатионпероксидаза способна эффективно разлагать гидроперекиси липидов и перекись водорода. Ее сродство к перекиси водорода выше, чем у каталазы, поэтому первая более эффективно работает при низких концентрациях перекиси, в то же время в защите клеток от окислительного стресса, вызванного высокими концентрациями перекиси водорода, ключевая роль принадлежит каталазе. Глутатионпероксидаза катализирует реакцию окисления глутатиона с образованием его конъюгированной формы, в ходе реакции перекись водорода разлагается до воды.

2G-SH + Н2О2 → G-S-S-G + 2Н2О

Фермент также катализирует реакцию восстановленного глутатиона с гидроперекисями липидов, при этом последние превращаются в жирные оксикислоты:

2G-SH + ROOH → G-S-S-G + R-OH+ Н2О

Наряду с этим, глутатионпероксидаза способна восстанавливать перекиси белкового и нуклеиновокислотного происхождения. Глутатионпероксидаза локализована в цитозоле (около 70 %) и митохондриях (20-30 %) всех клеток млекопитающих. Активный центр фермента содержит четыре атома селена, ковалентно связанных в форме селеноцистеина. Недостаток селена в рационе питания сопровождается снижением активности глутатионпероксидазы в клетках и, соответственно, пониженной устойчивостью организма к окислительному повреждению. В тяжелых случаях это может приводить к развитию аналогичной авитаминозу Е свободнорадикальной патологии, для которой характерны ожирение, некробиотические изменения в печени и гемолиз эритроцитов (болезнь Кешана).

Еще одним ферментом, использующим глутатион для осуществления АО-защиты, является глутатионтрансфераза. Глутатионтрансфераза содержится преимущественно в цитозоле клеток, в печени человека она составляет 2-4 % от общего количества цитозольного белка. Фермент, а точнее, группа ферментов, осуществляет конъюгацию восстановленного глутатиона с гидрофобными соединениями и восстановление органических перекисей. Элиминация производных липофильных ксенобиотиков, а также продуктов ПОЛ, в том числе гидроперекисей жирных кислот, осуществляется посредством их восстановления, нуклеофильного замещения или присоединения к молекуле глутатиона:

ROOH + 2G - SH → ROH +G - S - S - G + H 2О+G - SH →R- S - G + XH+ G - SH → HR - SG

В отличие от глутатионпероксидазы, для которой лучшими субстратами являются гидрофильные гидропероксиды с малым размером молекулы, глутатионтрансфераза не взаимодействует с перекисью водорода, а восстанавливает гидрофобные гидропероксиды с большим объемом молекулы: гидроперекиси полиненасыщенных жирных кислот - линоленовой и арахидоновой, а также фосфолипидов. Кроме этого, фермент восстанавливает гидроперекиси мононуклеотидов и ДНК, участвуя тем самым в их репарации. Глутатионтрансфераза - важный компонент АО-защиты, обеспечивающий удаление многих метаболитов окислительного стресса. Восстановленный глутатион необходим для нормальной работы глутатионзависимых ферментов. Поддержание его достаточного уровня осуществляется посредством синтеза, за счет его десорбции из связей с белками или же путем восстановления из окислений формы. Эта реакция осуществляется ферментом глутатионредуктазой, относящейся к флавопротеинам.

G-S-S-G + НАДФН + Н+ → 2G - SH + НАДФ +

Глутатионредуктазная система позволяет быстро пополнять пул восстановленного глутатиона в тканях. Основным источником НАДФН для этой реакции служит пентозный цикл окисления глюкозы, при этом НАДФ-зависимые дегидрогеназы пентозного цикла активируются окисленным глутатионом.

Снижение содержания восстановленного глутатиона в тканях создает благоприятные условия для блокирования SH-групп, входящих в состав ферментов и структурных белков клетки. Считается, что глутатион является основным агентом, защищающим тиоловые ферменты от окисления. К числу тиоловых ферментов относятся многие оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы и лигазы. Окисление SH-групп нарушает функционирование глкюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы, лактатдегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы, АТФ-азы, моноаминоксидазы, ксантиноксидазы, глутатионредуктазы и каталазы. Приведенные факты подтверждают мнения о том, что тиоловые соединения принимают самое непосредственное и широкое участие в механизме функционирования ферментативного звена АО-системы, выполняя не только антирадикальное, но и антиперекисное действие.

Водорастворимые низкомолекулярные тиоловые соединения: глутатион и эрготионеин. Первый из них является компонентом небелковой тиолдисульфидной окислительно-восстановительной системы и представляет собой трипептид, образованный аминокислотами цистеином, глутаминовой кислотой и глицином. Глутатион существует и двух формах - восстановленной (до 97% от общего количества) и окисленной. Наряду с другими серосодержащими соединениями, глутатион является ингибитором АФК и стабилизирует клеточные мембраны. Ему принадлежит ведущая роль в нейтрализации гидроксильного радикала, образующегося в реакции Фентона или в результате ридиолиза воды под действием ионизирующих излучений .

1.6 Патогенетические механизмы нарушений, развивающиеся при нарушении баланса антиоксидантной и прооксидантной систем

Нарушение сбалансированности антиоксидантной (АОС) и прооксидантной систем (ПОС) обусловливает развитие окислительного стресса (ОС). Токсическое действие АФК проявляется при состояниях ОС, который сопровождается резкой интенсификацией свободно-радикальных процессов в тканях. Это является важнейшим патогенетическим звеном развития многих воспалительных процессов, радиационных поражений, сердечно-сосудистых, онкозаболеваний, химических и других интоксикаций. Механизм генерации АФК при многих патологических состояниях носит общий характер. Некоторые отличительные особенности можно выявить только на начальных стадиях. Так, при воспалительных процессах пусковым фактором интенсификации свободнорадикальных процессов является дыхательный взрыв, при гипоксии - нарушение в первую очередь системы тканевого дыхания, при химических поражениях - активация системы микросомального окисления. Таким образом, причины, вызывающие интенсификацию свободно-радикальных процессов, могут быть разными, но изменения на молекулярном уровне носят однотипный характер и процессы генерации АФК взаимосвязаны. Некоторые антиоксиданты в условиях ОС могут выступать в качестве прооксидантов. При состояниях ОС возрастает восстановительный потенциал клетки за счет субстратов, коферментов в восстановленном состоянии, что приводит к снижению рН в очагах ишемии тканей сердца и головного мозга. Это создает условия для повышения пула "активных форм" металлов переменной валентности. В условиях повышеной генерации АФК они могут участвовать в реакциях, связанных с генерацией радикальных продуктов. Так, в присутствии Fe/Cu и О2 тиолы (RSH) являются источниками радикалов, RS, О2-, Н2О2 и ОН, НАДФН-радикалов НАД(Ф), аскорбиновая кислота - семидегидраскорбат радикала . Повышение уровня АФК сопряжено с интенсификацией процессов окислительной деструкции липидов, белков, нуклеиновых кислот, углеводов. Именно интенсификация этих процессов является основной причиной цитотоксического поражения тканей.

Как уже указывалось, причиной накопления активных форм кислорода являются нарушения нормального окислительного метаболизма клеток при патологии (шунтирование кислородом электротранспортных путей в митохондриях и в системе макросомального окисления при «утечке» электронов, трансформация дегидрогеназных путей в оксидазные, реакции аутоокисления, например, катехоламинов и пр.).

В концентрациях, превышающих физиологические, все эти соединения являются высокотоксичными для биологических систем всех уровней, от молекулярно-клеточного до организменного. Свойство осуществлять окислительное повреждение и деструкцию компонентов живых систем, обусловленное активными производными кислорода, получило обозначение как «токсичность кислорода».

Свободные радикалы кислорода являются нестойкими химическими соединениями и легко вступают в реакции с биомолекулами, вызывая их модификацию или деструкцию. Объектами неспецифических несанкционированных окислительных реакций с участием кислорода и его химически активных производных могут служить молекулы различной химической природы. АФК способны разрывать любую углеводородную связь и легко разрушают высокомолекулярные соединения: гиалуроновую кислоту, протеогликаны, коллаген, иммуноглобулины. В присутствии ионов двухвалентного железа АФК превращают оксигемоглобин в метгемоглобин. Окисление функциональных групп биологически активных веществ является причиной деградации структурных белков и липидов клеточных мембран и нуклеиновых кислот, ингибирования ферментов, изменения структуры и свойств гормонов и их рецепторов.

Результатом взаимодействия активных производных кислорода с молекулой ДНК является структурная модификация азотистых оснований, разложение пятичленного кольца дезоксирибозы, а также расщепление сахарофосфатного остова, что в конечном итоге приводит к фрагментации этого полимера. Доказано, что избыточная выработка АФК, в частности, супероксиданион-радикала, синглетного кислорода и гидроксильного радикала, может явиться причиной ряда хромосомных аббераций и мутаций ряда генов в лимфоцитах человека. Взаимодействие АФК с белками приводит к структурным изменениям этого типа биомолекул, заключающимся в модификации боковых группировок аминокислотных остатков, фрагментации полипептидных цепей и образованию ковалентных связей внутри молекул и между ними. Толерантность белков к АФК зависит от их аминокислотного состава, к свободнорадикальному повреждению более чувствительны циклические и серосодержащие аминокислоты. Из 20 незаменимых аминокислот наиболее уязвимыми для АФК, в частности для синглетного кислорода, являются гистидин, триптофан, метионин, тирозин и цистеин. Отличительной особенностью окислительного повреждения липидов в составе клеточных мембран является то, что в гидрофобной области их жирнокислотных остатков способен аккумулироваться молекулярный кислород. В результате этого, а также тесного и параллельного расположения по отношению друг к другу соседних жирнокислотных остатков создаются условия для развития окислительных повреждений по типу цепных реакций. Из-за ключевой роли в такой экспансии органических гидроперекисей этот процесс получил наименование перекисного окисления липидов .

2. Свободнорадикальное (перекисное) окисление липидов

Основными субстратами ПОЛ являются полиненасыщенные высшие жирные кислоты (ВЖК), находящиеся в структуре фосфолипидов мембран. На разных стадиях пероксидации ВЖК образуются диеновые и триеновые конъюгаты, пероксиды БЖК (R-ОО˙), гидроперекиси ВЖК (R-ООН), эндоперекиси, малоновый диальдегид и новые свободные радикалы. Сильнейшим катализатором процесса являются ионы металлов (Fe2+). Процесс может оборваться при образовании продуктов, не содержащих свободных радикалов.

Процессы ПОЛ можно условно подразделить на три последовательных этапа, или фазы развития: процессы зарождения цепей, процессы развития цепных реакций и обрыв цепей. На стадии зарождения цепей под действием свободных радикалов кислорода, ионизирующей радиации, ультрафиолетового облучения и ряда химических веществ, относящихся к прооксидантам, происходит образование органических радикалов (R).

О2 + R-H→R˙ + НО2

О2 + R-H→R˙ + НО2

ОН˙ + R-H → R˙ +Н2О

На следующей стадии радикал быстро взаимодействует с кислородом, который выступает в качестве акцептора электронов. В результате происходит образование пероксирадикала (RO2), который атакует ненасыщенные липиды. Возникновение в результате этой реакции органических перекисей и нового радикала (R) способствует продолжению окислительных реакций, приобретающих цепной характер:

R + О2 → RO2;+ RH → ROOH + R

Органические перекиси (ROOH) включаются в процесс генерации радикалов, в присутствии металлов переменной валентности (меди, кобальта, марганца, железа) происходит образование реакционного алкоксильного радикала:

ROOH + Me n+→RO + ОН ˉ + Me (n+1)-

Часть образующихся органических радикалов взаимодействует друг с другом, при этом происходит образование неактивных молекул, что обрывает ход реакций свободнорадикального окисления:

RO2 + R → ROOR

Гидроперекиси липидов способны подвергаться нерадикальным - окислительным превращениям, что приводит к образованию первичных (диеновые коньюгаты, диальдегиды), промежуточных (основания Шиффа) и конечных продуктов ПОЛ, а также спиртов, кетонов и альдегидов. Обрыв цепных реакций перекисного окисления возможен при взаимодействии радикалов со специализированными ферментными системами, а также с рядом низкомолекулярных веществ, совокупно формирующих биохимический компонент антиоксидантной системы организма

Избыточная активация ПОЛ может возникать как следствие резких изменений кислородного режима клетки. При этом гипероксия является причиной временного усиления процессов ПОЛ, а стойкая гипоксия ведет к лавинообразному накоплению токсичных продуктов перекисного окисления. Чрезмерная интенсивность реакций ПОЛ развивается под действием внешних воздействий, к которым можно отнести ионизирующее и ультрафиолетовое облучение, а также ряд химических веществ, относящихся к прооксидантам. Продукция АФК и, соответственно, интенсивность процессов ПОЛ в клетках резко возрастают как неспецифическая реакция при действии на организм различных стрессорных факторов химической, физической и биологической природы. В конечном итоге все эти воздействия могут приводить к напряжению и последующей декомпенсации механизмов антиоксидантной защиты организма и развитию окислительного стресса, проявляющегося на клеточном, тканевом и организменном уровнях. Типовые патологические процессы, такие как гипоксия и воспаление, свойственные и развивающиеся при большинстве соматических и инфекционных заболеваний, тяжелых травмах и ранениях, всегда сопровождаются избыточным образованием АФК и продуктов ПОЛ

Длительная активация процессов ПОЛ сопровождается развитием синдрома липидной пероксидации. При чрезмерной активации ПОЛ, когда, значительная часть мембранных фосфолипидов подвергается окислительной деградации, липидная фаза мембран становится более ригидной. Это ограничивает конформационную подвижность полипептидной цепи, вследствие чего снижается функциональная активность ферментов, рецепторов и каналообразующих белков, встроенных в мембраны, что в свою очередь препятствует удалению Са+2 из саркоплазмы и обеспечивает повреждающее действие кальция на клеточные органеллы. К настоящему времени доказана способность метаболитов ПОЛ ингибировать К+/Na+-АТФазу плазматической мембраны, вызывать цитолиз гепатоцитов с развитием ферментемии. Продукты ПОЛ нарушают нормальное функционирование кальциевых каналов L-типа, что сопровождается электролитными нарушениями в клетках миокарда. Их избыток приводит к сдвигу метаболизма арахидоновой кислоты, в результате чего одно из образующихся соединений (15-гидроарахидоновая кислота) снижает β-адренергическую стимуляцию за счет угнетения этого типа адренорецепторов. Продукты этих реакций повреждают мембраны эритроцитов, окислят альбумин сыворотки, нарушают синтез нуклеиновых кислот в клетках.

Активированные формы кислорода и продукты ПОЛ повреждают гиалуроновую кислоту, протеогликаны, коллаген, иммуноглобулины. Некомпенсированная антиоксидантной системой генерация активированных форм кислорода может вызвать повреждающее действие на эндотелий и базальную мембрану сосудов непосредственно или опосредованно через инактивацию антиоксидантных систем. Морфологически выявляемые гранулы липофусцина, состоящие из отложений нерастворимых липоперекисей и белков, являются продуктами ПОЛ.

АФК и продукты ПОЛ способствует избыточной выработке и высвобождению ряда провоспалительных цитокинов (фактора некроза опухолей, интерлейкина-1, интерлейкина-6) и медиаторов воспаления (гистамина, брадикинина, серотонина), производных арахидоновой кислоты - лейкотриенов, простагландинов и тромбоксанов. Избыточная выработка АФК и продуктов ПОЛ обусловливает резкую активацию системы комплемента по альтернативному пути с высвобождением анафилатоксина .

2.1 Участие АФК и продуктов ПОЛ в патогенезе заболеваний человека

Для большинства или почти всех патологичгских состояний, течение которых сопровождается участием АФК, присуще так называемое состояние окислительного стресса, характеризующееся интенсификацией продукции этих субстанций. Следует отметить, что состояние окислительного стресса является характерным не только для заболеваний, но имеет место и при физиологическихсостояниях, близких к экстремальным - интенсивных физических и психоэмоциональных нагрузках, переутомлении, а также при старении организма. Существует «свободнорадикальная теория старения», ее создатель Д. Хармен, впервые изложивший основные положения теории в 1955 г. Теория Хармана базируется на системе аргументаций, связанной со способностью свободных радикалов неспецифически повреждать такие макромолекулы, как ДНК, липиды и белки, а процесс старения связывается с накоплением таких повреждений в организме. В рамках этой теории находит объяснение не только старение ррганизма, но и широкий круг связанных со старением патологических процессов: сердечнососудистые заболевания, возрастные дисфункции мозга, иммунодепрессия, канцерогенез и другие виды патологии.

При всех заболеваниях, где в качестве обязательного компонента присутствует воспалительная реакция, ведущую роль в повреждении клеток и тканей организма выполняют АФК, продуцируемые лейкоцитами, главном образом, нертрофилами. Хотя наиболее разрушительные формы АФК, генерируемые миелопероксидазой, действуют в фаголизосомах лейкоцита, однако в очаге воспаления нейтрофилы способны секретировать этот фермент и во внеклеточное пространство. Уничтожение инфекционного агента при развитии воспалительного процесса может обеспечиваться и ценой попутного повреждения собственных тканей в очаге воспаления, при этом кислородзависимое повреждение тканей носит как прямой, так и опосредованный характер. Последний реализуется при воздействии АФК на регуляторные и эффекторные молекулы, например, на протеиназы и ингибиторы протеиназ. АФК могут прямо активировать латентные формы коллагеназы секретируемые нейтрофилами, а также инактивировать универсальный ингибитор протеиназ - α2-макроглобулин и специфический ингибитор сериновых протеиназ - αı-антитрипсин. АФК, генерируемые внутриклеточно, а также проникающие внутрь через клеточную мембрану, являются пусковыми факторами индукции апоптоза.

Свободнорадикальный механизм повреждения плазматических, митохондриальных и ядерных мембран, ядерного и митохондриального генома, липопротеинов крови приводит к повреждению сосудов и гистогематических барьеров, что играет важнейшую, нередко решающую роль в патогенезе наиболее распространенных заболеваний воспалительной, токсической и аутоиммунной природы.

Патогенетическая роль АФК выявлена к настоящему времени приблизительно для сотни заболеваний человека. Это имеет место при сердечно-сосудистой патологии - ишемической болезни сердца, инфаркте миокарда, острой артериальной непроходимости сегмента конечности, ишемических и реперфузионных поражениях почек, головного мозга и других тканей, в развитии катаракты и атеросклероза. Показано, что формирование атеросклеротических бляшек в интиме сосудов происходит при активном участии свободных радикалов, взаимодействующих с полиненасыщенными жирными кислотами. В основе патогенеза системной красной волчанки лежит повышенная чувствительность нуклеиновых кислот (в частности, ядерного ДНК) к повреждающему действию свободных радикалов. Предрасполагающим фактором заболевания является диета с избыточным количеством полиненасыщенных жирных кислот.

АФК играют важную роль при бронхолегочной патологии, как при острых, так и при хронических заболеваниях (например, эмфиземе, астме и хроническом бронхите). Чрезвычайно важное значение свободные радикалы имеют в патогенезе респираторного дистресс-синдрома. Именно АФК, вырабатываемые нейтрофилами крови, отводится ведущая роль в повреждении эндотелиально-альвеолярного барьера, развитии интерстициального отека и развернутой клиники этого синдрома. Чрезмерная и длительная стимуляция ферментных систем, отвечающих за генерацию активных радикалов фагоцитов, лежит в основе механизмов формирования профессиональной пылевой болезни и таких ее осложнений, как системный коллагеноз и злокачественное перерождение клеточных элементов легких и плевры. Многолетнее ретроспективное исследование, проведенное в 23 странах под эгидой ВОЗ, выявило прямую зависимость частоты развития некоторых видов злокачественных новообразований легких, молочной железы, яичников и прямой кишки от количества потребляемых животных жиров и интенсивности процессов ПОЛ в организме .

Многочисленные исследования свидетельствуют, что процессы свободнорадикального окисления лежат в основе патогенеза многих хронических заболеваний печени, причем избыточное образование АФК и продуктов ПОЛ проявляется на самых ранних стадиях процесса. Гепатотоксическое действие радикалов кислорода проявляется на мембранах клеток, являющихся основным местом синтеза супероксиданион-радикала. Усиление продукции АФК в результате индукции ксантиноксидазы интерфероном происходит даже при вирусном поражении. Радикалы кислорода повреждают мембранный аппарат гепатоцита, разрушают липидный слой его мембран, а также повреждают белки - ферменты монооксигеназной системы. Тяжесть течения и прогноз развития хронического заболевания печени тесно связаны с функциональным состоянием антиоксидантной системы гепатоцитов.

Избыточная активация ПОЛ является причиной возникновения и прогрессирования гипертонической болезни. Установлено, что под влиянием АФК и продуктов ПОЛ нарушаются проницаемость клеточных мембран и активность Na+/K+-АТФазы, что приводит к накоплению в клетках ионизированного кальция. Кроме этого, вторичные продукты ПОЛ способны прямо воздействовать на тонус артериальных сосудов. Кроме сосудосуживающего действия, радикалы кислорода активируют работу фибробластов соединительной ткани, в результате чего развивается артериокапиллярный фиброз, т. е. необратимые изменения сосудов. Окислительный стресс практически всегда развивается при инфекционных заболеваниях. Избыточное образование свободных радикалов кислорода является одним из ведущих механизмов в патогенезе гриппа. Генерирование АФК определяет мутагенез и протеолитическую активность вируса гриппа, цитопатический эффект вирусной инфекции, деструкцию капиллярной сети и стенок капилляров, развитие сливных пневмоний и отека легких.

Токсическое повреждение нейронов АФК, продуктами ПОЛ и окислительный стресс рассматриваются в качестве ведущего механизма при нейродегенеративных заболеваниях. Одной из причин развития рассеянного склероза могут быть митохондриальные нарушения, сопровождающиеся избыточной продукцией АФК. Активный кислород при рассеянном склерозе обладает непосредственно поражающим действием на ЦНС и является причинным фактором развития заболевания. Окислительное повреждение приводит к гибели нервных и глиальных клеток, что проявляется демиелинизацией и образованием очагов глиоза в ЦНС. В 37% случаев у людей с болезнью Паркинсона наблюдается дефектность первого комплекса дыхательной цепи в клетках черной субстанции. Постепенная кумуляция метаболитов кислорода, продуктов ПОЛ, металлопротеинов и развитие окислительного стресса в различных отделах ЦНС имеют особое значение при болезни Альцгеймера и хорее Гентингтона. Процессы накопления липофусцина в клетках ЦНС при этих состояниях соотносятся с уровнем антиоксидантных энзимов в мозговой ткани.

АФК и продукты ПОЛ оказывают прямое деструктивное действие на внутренние органы и приводят к развитию полиорганной недостаточности после тяжелых травм и обширных ожогов. Радиолиз воды, образование свободных радикалов кислорода и разнообразных метаболитов ПОЛ лежат в основе патогенеза острых и хронических радиационных поражений и человека .

2.2 Диагностика процессов перекисного окисления

Четких клинических признаков избыточной активации свободнорадикального окисления в организме человека нет. Развитие окислительного стресса у пациента сопровождается:

признаками дыхательной недостаточности и недостаточности

кровообращения (чаще имеет место гипердинамический тип кровообращения);

психомоторным возбуждением;

повышением температуры более 37,5° С;

выраженной болевой реакцией.

Лабораторными признаками окислительного стресса авторы считают:

повышение количества лейкоцитов в крови (> 10 тыс.) без палочкоядерного сдвига в ближайшее время после травмы (10-12 ч.);

увеличение содержания в крови аланиновой и аспарагиновой трансаминаз;

повышение концентрации глюкозы плазмы крови > 7,0 ммоль/л;

некомпенсированный метаболический ацидоз (рН < 7,2);

Для лабораторной диагностики выраженности окислительного стресса и определении показания для использования препаратов с антиоксидантными свойствами целесообразно оценивать состояние антиоксидантной системы, а также интенсивности свободнорадикальных реакций (процессов ПОЛ) в организме пациента. Оценка состояния антиоксидантной системы обычно включает в себя определение активности основных ферментных АО (активность СОД, каталазы и глутатионпероксидазы эритроцитов), а также содержание аскорбиновой кислоты, токоферола и селена в крови. Инструментальная оценка выраженности свободнорадикальных реакций предусматривает определение в пробах крови или тканей продуктов реакций перекисного окисления, к которым относят диеновые конъюгаты, малоновый диальдегид, основания Шиффа и активные формы кислорода. Совокупность этих показателей позволяет оценивать как состояние основных звеньев АО-системы организма, т. е. ее способность предотвращать избыточный ход реакций свободнорадикальной природы, так и фактическую интенсивность реакций ПОЛ и синтеза АФК. Исходя из этого, данные тесты могут рассматриваться в качестве лабораторных критериев диагностики окислительного стресса.

Лабораторная диагностика интенсивности ПОЛ необходима для суждения об АО-активности того или иного препарата, так как на основании клинических признаков невозможно адекватно оценить деиствие АО-препарата. Отметим, что использование только одного из указанных выше тестов не дает полной информации. Динамика показателей интенсивности свободнорадикальных реакций и содержание АО в организме порой имеют противоположную направленность. В ряде случаев колебания содержания продуктов свободнорадикальных реакций не сопровождаются изменением уровней активных форм кислорода, и наоборот. Резкая интенсификация свободнорадикальных реакций и накопление продуктов этих реакций в крови может не приводить к изменению содержания и активности основных компонентов АО-системы. Для достоверной и адекватной клинической интерпретации получаемых результатов принципиальное значение имеет не только абсолютная величина показателей, а их динамика на фоне проведения лечебных мероприятий.

Лабораторные критерии диагностики окислительного стресса

Оценка состояния антиоксидантной системы пациентаОпределение интенсивности свободнорадикальных реакцийСодержание и активность антиоксидантных ферментов в эритроцитах или других, доступных для изучения клетках: Супероксиддисмутазы Каталазы ГлютатионпероксидазыСодержание в плазме (сывортке) крови первичных, вторичных и промежуточных продуктов перекисного окисления липидов: Диеновых коньюгат Малонового диальдегида Оснований ШиффаСодержание в крови низкомолекулярных антиоксидантов: Аскорбиновой кислоты Токоферола СеленаСодержание в крови активных (радикальных) форм кислорода: Супероксиданион-радикала Синглетного кислорода Общий уровень радикаловКаждый из предложенных показателей имеет свои достоинства и недостатки. Основными требованиями, предъявляемыми к лабораторным методам, являются точность, простота выполнения и хорошая воспроизводимость. Желательными являются простота подготовки проб к исследованию и возможность их хранения, что позволяет не проводить все тесты ex tempore. Наиболее широко распространенный в экспериментальных исследованиях и клинической практике метод определения малонового диальдегида в реакции с тиобарбитуровой кислотой не является точным показателем, отражающим течение процессов ПОЛ, так как в ходе реакции тиобарбитуровая кислота взаимодействует с веществами нелипидной природы, имеющими в своем составе кето-группу, например, с глюкозой. Взаимодействие же тиобарбитуровой кислоты с малоновым диальдегидом, исходно содержащимся в липидных системах, в количественном отношении играет незначительную роль. Тем не менее на протяжении почти тридцати лет метод является наиболее употребимым большинством исследователей при изучении процессов ПОЛ в различных биологических системах. К его достоинствам можно отнести простоту и относительную быстроту выполнения, а также хорошую воспроизводимость результатов. Другими распространенными методами оценки интенсивности реакций ПОЛ является определение уровня первичных и промежуточных продуктов этих реакций, т. е. диеновых конъюгатов и оснований Шиффа. Методы точны и относительно просты для воспроизведения. К их недостаткам относится невозможность хранения отобранных проб, поэтому исследования должны проводиться сразу или в пределах получаса после их отбора. Более точным и адекватным показателем интенсивности и выраженности свободнорадикальных реакций и, соответственно, состояния анти-оксидантной системы организма, является определение АФК - основных предшественников реакций ПОЛ; быстрое и точное измерение уровня которых в цельной крови осуществляется люминесцентным методом. В зависимости от вида используемого люминофора (люминол, люцигенин и т. д.) возможно определение как отдельных видов АФК, так и их общее количество. Метод отличается быстротой выполнения, его можно рекомендовать для экспресс-диагностики. Методика позволяет хранить пробы гепаринизированной крови для исследования до 12 ч при температуре +4˚С, т. е в обычном бытовом холодильнике.

Основные показатели, характеризующие оксидантно-антиоксидантную систему.

Интенсивность ПОЛ - оценивается по концентрации в крови и других биологических жидкостях промежуточных и конечных продуктов реакции.

Малоновый диальдегид (МДА) - конечный продукт ПОЛ.

Нормальная концентрация в крови - 2,5-6,0 мкМ/л. Зависит от метода определения, поэтому в каждой лаборатории имеется собственный референтный интервал.

Увеличение концентрации - свидетельство усиленного ПОЛ и срыва антиоксидантной защиты.

Определение малонового диальдегида в крови флуориметрическим методом (Федорова Т. Н., Коряцива Т. С, Ларский Э. Г.)

Принцип метода: тиобарбитуровая кислота (ТБК) в кислой среде взаимодействует с низкомолекулярными диальдегидами (главным образом с малоновым) с образованием окрашенного в розовый цвет комплекса.

Нормативные величины: 3,7±0,12 ед.

Модификация определения продуктов перекисного окисления липидов в реакции с тиобарбитуровой кислотой (Коробейников Э. Н.)

Принцип метода: при нагревании в кислой среде часть продуктов ПОЛ, относящихся к классу гидроперекисей, разлагается с образованием малонового диальдегида, взаимодействие молекулы которого с двумя молекулами тиобарбитуровой кислоты приводит к формированию окрашенного комплекса.

Нормативные величины: 3,69±0,14нмоль/л.

Определение перекисей липидов в реакции с тиобарбитуровой кислотой (Гаврилов В. Б., Гаврилова А. Р., Мажуль Л. М.)

Принцип метода: тиобарбитуровая кислота реагирует с малоновым диальдегидом, который образуется при переокислении ненасыщенных жирных кислот, имеющих 2-3 диеновые связи, с образованием розового продукта, имеющего максимальное поглощение при 535 нм.

Нормативные величины: 100-120 нмоль/л.

Определение диеновых коньюгатов в плазме крови по УФ-поглощению

гептановых и изопропанольных экстрактов (Гаврилов В. Б.,

Гаврилова А. Р., Хмара Н. Ф.)

Принцип метода: метод основан на измерении интенсивности поглощения в области 223- 234 нм, обусловленной конъюгированными диеновыми структурами (предварительно экстрагированными из плазмы), возникающими при образовании гидроперекисей полиненасыщенных жирных кислот.

Спектрофотометрическое определение содержания ацилгидроперекисей (диеновых конъюгатов) в плазме (сыворотке) крови.

Принцип метода основывается на установлении содержания первичных продуктов ПОЛ в крови по поглощению липидным экстрактом монохроматического светового потока в ультрафиолетовой области спектра (233 нм).

Витамины с антиоксидантными свойствами.

Витамин А (ретинол) - жирорастворимый витамин, содержащийся в животных продуктах в форме А, и А2, в растениях в форме провитамина - каротина, наиболее активным среди которых является бета-каротин.

Нормальная концентрация в сыворотке - 1,05-2,27 мкМ/л или 300-650 мкг/л.

Недостаточность витамина А, которая может возникать не только при дефиците ретинола или каротина в пище, но и из-за нарушения их всасывания при заболеваниях кишечника, а также при малом количестве жира и белка в пище, способствует усилению ПОЛ. В большей степени страдает эпителий различных органов и глаза (замедление восстановления зрительного пурпура - родопсина). Это проявляется повышенной восприимчивостью к бронхолегочным заболеваниям, инфекциям мочевыводящих путей, слизистой оболочки глаз, кожи, снижением остроты зрения в темноте («куриная слепота»).

Витамин Е (токоферолы) - группа веществ, среди которых наибольшей активностью обладает альфа-токоферол. Жирорастворимый витамин, действует сопряженно с витамином А. В сыворотке крови и клетках основная часть связана с липопротеидами.

Определение уровня альфа-токоферола в плазме крови.

Принцип метода: Альфа-токоферол плазмы экстрагируют смесью «этанол-гексан». Отобранную гексановую фазу выпаривают. К полученному остатку добавляют хлорное железо, способное восстанавливаться из трехвалентного состояния в двухвалентное под действием антиоксидантов (и прежде всего альфа-токоферола). О количестве альфа-токоферола судят по содержанию восстановленного железа, которое определяют реакцией с альфа-2-,альфа-2-дипиридилом, сопровождающейся образованием комплекса красного цвета.

Нормальная концентрация в сыворотке крови - 5-20 мг/л.

Степень обеспеченности организма витамином Е можно характеризовать путем непосредственного определения его концентрации в крови, и косвенным методом, определяя перекисную резистентность эритроцитов .

Перекисная резистентность эритроцитов (ПРЭ) - показатель обеспеченности мембран антиоксидантами, в первую очередь витамином Е, и их устойчивости к повреждающему действию перекисей.

Нормальная величина - до 10%.

Увеличение свидетельствует о недостаточной антиоксидантной защите клеточных мембран, высокой подверженности ПОЛ и лабильности. Имеются сезонные колебания ПРЭ с повышением процента перекисного гемолиза в весенний период. .

Витамин С (аскорбиновая кислота) - водорастворимый витамин, который, в отличие от животных, в организме человека не синтезируется и поступает только с пищей. Предотвращает окисление витаминов А и Е, восстанавливает окисленные формы ферментов и различных субстратов участвует в большом количестве обменных реакций. Регулирует проницаемость сосудистой стенки, существенно усиливает устойчивость организма к инфекциям, необходим при образовании коллагена, заживлении ран и ожогов.

Нормальная концентрация:

в крови -6-20 мг/л,

в моче -20-30 мг/сутки.

Суточная потребность - 45-60 мг; существенно возрастает при физической и нервно-психической нагрузке, низкой и высокой температуре, облучении, курении (1 сигарета разрушает 25 мг витамина С), беременности и кормлении, хронических заболеваниях желудочно-кишечного тракта, приеме антибиотиков и сульфаниламидов. Аскорбиновую кислоту не рекомендуется принимать онкологическим больным в период лучевой и химиотерапии.

Недостаточность витамина С в пище способствует усилению ПОЛ, нарушениям обмена многих веществ, функций нервной и эндокринной систем, снижению устойчивости к инфекциям и проявляется слабостью, повышенной утомляемостью, раздражительностью, болями в конечностях и другими неспецифическими симптомами. Длительный авитаминоз вызывает развитие цинги.

Антиоксидантные ферменты.

Супероксиддисмутаза (СОД) - фермент, катализирующий реакцию нейтрализации супероксидного радикала О2. Является основным ферментом внутриклеточной антирадикальной защиты. Нормальная активность в эритроцитах (метод восстановления НСТ) - 1,04 ± 0,05 усл. ед./мг гемоглобина. Абсолютные величины колеблются в зависимости от используемых реактивов. Наиболее доступной для анализа является эритроцитарная СОД, содержащая CuZn.

Определение активности эритроцитарной СОД методом R. Fried. Принцип метода: метод основан на определении степени ингибирования под действием эритроцитарной СОД реакции восстановления нитросинего тетразолия супероксидными радикалами.

Исследование активности СОД выполняют при комнатной температуре. Кровь должна быть взята с гепарином. Фермент может оставаться стабильным до 1 недели при хранении при температуре +4 С.

Активность фермента выражают в условных единицах (усл. Ед.). 50% ингибирования процесса восстановления нитросинего тетразолия по сравнению с контрольной пробой принято считать 1 усл. ед.

Нормативные величины:1,04±0,3/мг гемоглобина.

В начальный период усиленного образования свободных радикалов происходит повышение активности СОД для их нейтрализации. Если процесс радикалообразования продолжает усиливаться, то на определенном этапе происходит истощение компенсаторных резервов и активность СОД снижается ниже нормы, что свидетельствует о декомпенсации данного защитного механизма.

Увеличение активности СОД наблюдается при отравлениях гашишем, четырёххлористым углеродом, амитриптилином, фосфорорганическими соединениями, уксусной кислотой, при септицемии, очаговом туберкулёзе, лейкозах, мышечной дистрофии Дюшена, муковисцидозе, талассемии, инфаркте миокарда, при психических заболеваниях.

Увеличение активности СОД без соответствующей активации или отсутствии других антиоксидантных ферментов - каталазы (гипо-, акаталаземия), пероксидаз является неблагоприятным изменением для организма из-за накопления перекиси водорода - продукта супероксиддисмутазной реакции.

Снижение активности СОД наблюдается при отравлении окисью углерода, соединениями свинца, кадмия, при септикопиемии, при ИБС, атеросклерозе сосудов головного мозга, при эпилепсии, у новорожденных с синдромом дыхательных расстройств, с ретинопатиями, у беременных с поздним токсикозом (диагностический тест для определения внутриутробной гипоксии плода). Низкие показатели активности фермента следует рассматривать как неблагоприятный прогностический признак, указывающий на снижение неспецифической резистентности организма.

Проводить определение активности СОД целесообразно с одновременным исследованием других компонентов АОЗ и показателей ПОЛ.

Каталаза - фермент, осуществляющий разложение перекиси водорода до кислорода и воды. Максимальное количество содержится в эритроцитах. Обладает специфической антиоксидантной защитной функцией в отношении эндотелиальных клеток.

Нормальная активность - 18,4 - 25,0 мкЕД/эритроцит.

В начальную компенсаторную фазу радикалообразования происходит повышение активности фермента, в фазу декомпенсации - снижение. С возрастом активность фермента падает.

Определение активности каталазы методом E. Beutler.

Принцип метода: метод основан на определении скорости разложения перекиси водорода в мМ/мин спектрофотометрически при длинне волны 230. Для стабилизации гемолизата и разложения комплекса каталаза - перекись водорода добавляют этанол.

Определения активности каталазы крови по методу Баха и Зубковой.

Принцип метода: метод основан на определении количества перекиси водорода, которое разрушается ферментом за 30 минут. В опыте определяют количество неразрушенной перекиси водорода в ходе каталазной реакции, в контроле количество перекиси,взятой в пробу с ферментом, инактивированным кипячением. Перекись водорода оттитровывают пермаганатом калия в кислой среде. Реакция идет по уравнению:

2KMnO + 5H2O2 + 4 H2 SO + 2 KMnSO + 8H2O +5O2

Разность между цифрами титрования контроля и опыта соответствует количеству разрушенной перекиси водорода под действием каталазы.

Нормативные величины:

Метод титрометрии: каталазное число 12-20. В одном мкл. Крови у мужчин содержится 4·10- 5·10 эритроцитов, у женщин 3,9·10 - 4,7·10 эритроцитов.

Метод фотометрии: по E. Beutler 15,31·10 ± 2,39·10 МЕ/г гемеглобина.

Увеличение активности каталазы наблюдается при гемолитических состояниях, при хирургических вмешательствах проводимых под местной анестезией, у детей с бронхолёгочной патологией, ревматойдным артритом, тиреотоксическим зобом.

Снижение активности каталазы наблюдается при инфекционных заболеваниях, железодефицитной анемии, синдроме мальабсорбции, карциноме, у новорожденных с синдромом дыхательных расстройств, хронических отравлениях фосфором, мышьяком, свинцом, ртутью, общем наркозе, назначении антибиотиков. Определение активности каталазы целесообразно проводить с одновременным исследованием активности других АО-ферментов, содержания метгемоглобина и продуктов ПОЛ.

Наиболее распространенным методом определения активности ГР является спектрофотометрический метод. Среди других методов следует отметить колориметрическое определение активности ГР по скорости образования восстановленного глутатиона при йодометрическом титровании или с помощью цветной реакции с нитропрусидом.

Определение активности ГР методом Бойтлера.

Принцип метода: метод основан на спектрофотометрическом определении количества израсходованного в ходе ферментативной реакции кофермента НАДФН, учитываемого по изменению поглощения при 340 нм. Длинна волны 340 нм соответствует максимуму поглощения восстановленного кофермента. В ходе реакции по мере окисления НАДФН оптическая плотность инкубационной пробы снижается.

Активность ГР значительно повышается в сыворотке больных саркомой, у больных карциномой молочной железы и при других неопластических заболеваниях. Увеличение ГР наблюдается при гепатитах, механической желтухе и реже - при циррозе. Высокие значения активности могут определяться при остром инфаркте миокарда. Как правило, мегалобластическая анемия сопровождается повышением уровня активности ГР.

Глутатионпероксидаза (ГП). Катализирует реакцию окисления глутатиона Г- SH перекисью водорода (1-я реакция) или гидроперекисями ROOH (2-я реакция), образующийся в результате ПОЛ.

Вклад ГП в обезвреживание перекиси водорода по сравнению с каталазой более значителен. Она имеет большее сродство к перекиси водорода и разлагает ее даже при небольших концентрациях. В активном центре фермента находится селен. На 1 моль фермента приходится 4 грамма атома селена.

Определение активности ГП методом E. Beutler.

Принцип метода: метод основан на определении скорости образования окисленного глутатиона, содержание которого определяется в сопряженной глутатионредуктазной реакции по степени окисления НАДФН при 340нм.

Г - S - S - Г + НАДФН→2Г - SH + НАДФ

В качестве гидроперекиси используют t-бутил гидропероксид.

Нормативные величины: По Beutler 30,8± 4,73 МЕ/г гемоглобина (при заборе крови с ЭДТА) и 34,2±3,84 МЕ/г гемоглобина (в гепаринизированной крови). По Тицу: 19,9±0,31 МЕ/моль гемоглобина и 0,89±0,14 НЕД/эритроцит.

Увеличение активности наблюдается при дефиците глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, α-талассемии, остром лимфоцитарном лейкозе.

Снижение активности ГП наблюдается при железодефицитной анемии, отравлении свинцом, серповидноклеточний анемии, дефиците селена.

Церулоплазмин (медная оксидаза). Медьсодержащий гликопротеид α2-глобулиновой фракции. Функции цирулоплазмина разнообразны: это основная оксидаза плазмы крови, реактант острой фазы, осуществляет транспорт Cu для синтеза СОД и цитохромоксидазы. Цирулоплазмин проявляет свои АО свойства экстрацеллюлярно без образования каких бы то ни было радикалов.

Чистый белок церулоплазмина имеет интенсивную голубую окраску.

Простой колориметрический метод, который предложил Ravin, широко используется в модификации (С.В. Бестужевой и В.Г. Колба).

Существуют и другие методы исследования: нефелометрический, манометрический и иммунологический. При манометрическом методе реакция проходит в аппарате Варбурга, измеряют скорость потребления кислорода (мкмоль потребленного кислорода за 1 мин на 1 литр сыворотки в определённых условиях). Отмечена превосходная корреляция между значениями, полученными колориметрическим методом Ревина и монометрическим. Колориметрический метод модифицирован для использования в автоанализаторе.

Определение активности цирулоплазмина модифицированным методом Ревина.

Принцип метода: метод основан не ферментном окислении n-фенилендиамина церулоплазмином. Реакция останавливается добавлением фтористого Nа. По оптической плотности образующихся окрашенных продуктов судят о концентрации церулоплазмина.

Уровень церулоплазмина в сыворотке увеличевается при различных инфекционных заболеваниях, при остром и хроническом воспалительных процессах, сопровождающихся деструктивными и некротическими изменениями в тканях, при злокачественном росте и шизофрении.

Антиоксидантная активность (АОА) - комплекс ферментативных и неферментативных реакций связывания и разложения промежуточных продуктов пероксидации, тормозящих свободно-радикальное окисление липидов. Определяется чаще всего методом хемилюминисценции в модельных системах.

Нормальная величина для сыворотки крови - 60-75%.

Высокий уровень АОА обеспечивает устойчивость к перекисным повреждениям клеточных мембран и низкий уровень ПОЛ.

Низкий уровень АОА способствует усилению ПОЛ, торможению процессов пролиферации и регенерации.

Клиническое значение определения АОА состоит в той, что одни патологические процессы развиваются на фоне повышенной АОА, а другие - на фоне сниженной АОА и поэтому требуют разнонаправленной коррекции. .

Заключение

Таким образом, в основе сохранения свободнорадикального гомеостаза лежит баланс между прооксидантными и антиоксидантными процессами, поддерживающими перекисное окисление в пределах, не только совместимых с жизнью, но и полезных для нее. Нарушение этого баланса является отправной точкой в инициации «свободнорадикальной патологии». Срыв антиоксидантной защиты характеризуется развитием свободнорадикальных повреждений разных компонентов клеток и тканей. Все клеточные компоненты в той или иной степени подвержены перекисному окислению, но наиболее выражен этот процесс в липидных (фосфолипидных) структурах, прежде всего в липидном бислое мембран. Нарушение про-, антиоксидантного равновесия, сопровождающееся увеличением концентрации продуктов ПОЛ в тканях и жидкостях организма, отмечено при самых различных заболеваниях: воспалительных, сердечнососудистых, онкологических, инфекционных, ожоговой и лучевой болезни, при разнообразных токсических воздействиях, а также при старении организма. Все это позволяет исследователям рассматривать активацию ПОЛ как универсальный компонент неспецифической реакции организма на экстремальные воздействия, т.е. как звено стресс-реакции.

Из изложенного выше следует, что механизм поддержания прооксидантно-антиоксидантного равновесия достаточно сложен. С одной стороны, действуют окислительные и проокислительные факторы и субстраты: молекулярный кислород, ОН˙, гидроперекиси, органические перекиси, эпоксиды, легко-окисляющиеся субстраты (липиды), окислительные ферменты и свободные ионы металлов с переменной валентностью, нейромедиаторы (катехоламины). С другой, - антиоксидантные компоненты; ферменты (СОД, ГПО, глутатионтрансфераза, каталаза), гормоны (стероидные и тиреоидные), биоамины (серотонин, гистамин), жирорастворимые антиоксиданты - компоненты мембран (токоферолы, убихиноны, ретиноиды, каротиноиды, фенольные соединения); водорастворимые антиоксиданты (тиоловые соединения, аскорбат, водорастворимые фенолы); ионы селена - свободные и в составе антиоксидантных ферментов.

Для лабораторной диагностики выраженности окислительного стресса и определении показания для использования препаратов с антиоксидантными свойствами целесообразно оценивать состояние антиоксидантной системы, а также интенсивности свободнорадикальных реакций (процессов ПОЛ) в организме пациента. В результате проведённого анализа литературы можно сделать вывод, что для оценки состояния интенсивности перекисного окисления липидов в организме человека необходимо использовать интегративные подходы, использование только одного из указанных выше тестов не дает полной информации. Также лабораторная диагностика интенсивности ПОЛ необходима для суждения об АО-активности того или иного препарата, так как на основании клинических признаков невозможно адекватно оценить деиствие АО-препарата.

Список использованных источников

Дубинина, Е. Е. Окислительный стресс как реакция адаптации организма к экстремальным условиям / Е. Е. Дубинина //Вопросы медицинской химии. - 2001. - № 6., том 47 - С. 561-581.

Балаболкин, М. И. Роль окислительного стресса в патогенезе сосудистых осложнений диабета / М. И. Балаболкин, Е. М. Клебанова // Проблемы эндокринологии. - 2000. - № 6. - С. 29-34.

Владимиров, Ю.А. Свободные радикалы в главных системах / Ю.А. Владимиров, О.А. Азизова; под ред. А.И. Деев. - М.: ВИНИТИ, серия биофизика, 1991. - 252 с.

Свободные радикалы. Определение, номенклатура, классификация [Электронный ресурс] / академик РАМН, профессор Владимиров Ю.А. - 2006. - Режим доступа: #"justify">Владимиров, Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. - М.: Медицина, 1972. - 252 с.

Шанин, Ю.Н. Антиоксидантная терапия в клинической практике / Ю.Н. Шанин, В. Ю Шанин, Е. В.Зиновьев. - Санкт - Петербург, ЭЛБИ - СПб., 2003 - 128 с.

Зайчик, А.Ш. Общая патофизиология (с основами иммунологии) / А.Ш. Зайчик, Л.П. Чурило. - Санкт - Петербург, ЭЛБИ - СПб., 2005. - 656 с.

Кашулина, А. П. Роль перекисного свободнорадикального окисления в патологии и методы его изучения / А. П. Кашулина, Е. Н. Сотникова // Мед. консультирование. - 1996. - № 2. - С. 20-24.

Буеверов, А. О. Оксидативный стресс и его роль в повреждении печени / А. О. Буеверов. // Российский журнал гастроэнторологии. - 2002. - № 4. - С. 21-25.

Хуцишвили, М. Б. Свободнорадикальные прцессы и их роль в патогенезе некоторых заболеваний / М. Б. Хуцишвили, С. И. Рапопорт. // Клиническая медицина. - 2002. - № 10. - С. 10-16.

Troy, C.M. Down-regulation of copper zinc superoxide dismutase causes apoptotic death in PC 12 neuronal cells / C.M. Troy // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1994. - № 14. - P. 6384 - 6387.

Болдырев, А. А. Введение в биомембранологию: учеб. пособие / Под ред. А. А. Болдырева. - М.: Изд-во МГУ, 1997. - 208 с.

Повреждение компонентов биологических мембран при патологических процессах [Электронный ресурс] / М.: - 2006. - Режим доступа: #"justify">Radi, R. Peroxynitrite-induced membrane lipid peroxidation: the cytotoxic potential of superoxide and nitric oxide / R. Radi // Arch. Biochem. Biophys. - 1991. - №2. - P. 481-487.

Даниловой, Л. А. Сборник по лабораторным методам исследования / Под ред. Л. А. Даниловой. - СПб.: Питер, 2003. - 736 с.

Лифшиц, В.М. В. И. Сидельникова. ″Медицинские лабораторные анализы″. Справочник. Издание второе исправленное и дополненное / В.М. Лифшиц, В. И. Сидельникова.- М.: ″Триада - Х″, 2003. - 312 с.

Николаев, А. Я. Биологическая химия / Николаев А. Я. - М.: Медицинское информационное агенство, 2001. - 496 с.

Похожие работы на - Лабораторная диагностика интенсивности перекисного окисления липидов

Окисление перекисное

сложный многостадийный цепной процесс окисления кислородом липидных субстратов, главным образом полиненасыщенных жирных кислот, включающий стадии взаимодействия липидов со свободнорадильными соединениями и образования свободных радикалов липидной природы. О. п. фосфолипидов биологических мембран играет важную роль в жизнедеятельности живых организмов. Усиление процессов О. п. имеет существенное значение в этиологии и патогенезе многих заболеваний и развитии последствий различных экстремальных воздействий.

Перекисное окисление является частным случаем жидкофазного окисления углеводородов. Оно представляет собой типичный цепной процесс с выраженным разветвлением. О. п. может включить стадии неферментативного аутоокисления и ферментативные реакции. Ферментативный и неферментативный пути О. п. приводят к образованию свободных радикалов липидов в несколько основных этапов: инициирование (зарождение цепи) , , продолжение цепи ; разветвление цепи ; обрыв цепи молекулярные продукты, молекулярные продукты, молекулярные продукты, где RH - субстрат окисления (полиненасыщенная жирная кислота). В инициировании О. п. решающую роль играют так называемые активные формы кислорода, в первую очередь кислородные радикалы, содержащие неспаренные электроны. В результате одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода О 2 в клетках образуется супероксидный анион-радикал который возникает в электронпереносящей цепи митохондрий, хлоропластов, в реакциях, катализируемых некоторыми окислительными ферментами, при аутоокислении моноаминов и других соединений. При реакции дисмутации двух супероксидных радикалов образуется молекула перекиси водорода Н 2 О 2 ; Другими источниками перекиси водорода являются реакции, катализируемые некоторыми оксидазами. В клетках существуют специальные системы обезвреживания токсичных кислородных радикалов, в частности ферментные: супероксиддисмутаза, катализирующая превращение супероксида в перекись водорода, и пероксидазы, катализирующие реакции, в которых перекись водорода восстанавливается до воды. К наиболее реакционноспособным и поэтому наиболее опасным радикалам кислорода относится гидроксильный радикал ОН - один из основных повреждающих факторов при действии на живой ионизирующего излучения (Ионизирующие излучения). Значительная часть радикалов ОН в живых организмах генерируется в результате реакций перекиси водорода и супероксидных радикалов с каталитическими количествами металлов переменной валентности, в первую очередь, с ионами и меди. Относительно малоактивные и долгоживущие и Н 2 О 2 могут служить источником взаимодействующего практически со всеми классами биомолекул радикала ОН в присутствии микроколичеств свободных железа или меди. Наряду с радикалом ОН непосредственными инициаторами О. п. могут быть и другие свободные радикалы, например протонированный супероксид-анион , а также синглетный и ряд других активных форм кислорода.

Продукты О. п., в частности перекиси липидов, используются в организме для синтеза биологически активных веществ - простагландинов (Простагландины), тромбоксанов, стероидных гормонов (Гормоны) и т.д. Интенсивность О. п. непосредственно связана с процессами обновления состава фосфолипидов биологических мембран, изменения относительного содержания липидов и белков и как следствие с изменением структуры биологических мембран и их функционирования. В живых организмах существует сложная регуляции интенсивности процесса О. п. В норме процессы образования и расходования продуктов О. п. хорошо сбалансированы, что определяет их относительно низкое содержание в клетках. Скорость О. п. на уровнях инициирования, продолжения и обрыва цепи в значительной степени определяется структурной организацией липидов в биологической мембране. которая влияет на остатков ненасыщенных жирных кислот (Жирные кислоты) для кислорода. Факторы, нарушающие «упаковку» липидов в биологической мембране, ускоряют, а факторы, поддерживающие структурированность липидов (например ), тормозят О. п. Другим регуляторным компонентом системы О. п. являются , участвующие в образовании (например, некоторые ) или гибели (супероксиддисмутаза) активных форм кислорода и свободных радикалов, а также в разложении перекисей без образования свободных радикалов (каталаза, пероксидазы). этих ферментов также может зависеть структурированности липидного бислоя биологической мембраны. Практически на всех стадиях О. п. существенную модуляторную роль играют факторы, регулирующие фосфолипидов биологических мембран и влияющие на скорость окисления путем изменения липидного состава мембран. Чрезвычайно важное значение в регуляции О. п. имеют многочисленные низкомолекулярные соединения, выполняющие функции инициаторов, катализаторов, ингибиторов, тушителей, синергистов этого процесса. К числу важнейших стабилизаторов биологических мембран относится природный антиоксидант ( О. п.) Е; другими природными антиоксидантами являются тироксин и , витамин К, . Свойствами прооксидантов (веществ, усиливающих О. п.) обладают ионы металлов переменной валентности, С, D и др.

При развитии патологического процесса баланс образования и расходования перекисей и других продуктов О. п. может нарушаться, О. п. накапливаются в тканях и биологических жидкостях, что приводит к серьезным нарушениям, в первую очередь, в биологических мембранах. Следствием активизации О. п. может быть изменение физико-химических свойств мембранных белков и липидов, изменение активности мембранно-связанных ферментов, нарушение проницаемости мембран (в т.ч. для протонов и ионов кальция), ионного транспорта (например, угнетение натриевого насоса), уменьшение электрической стабильности липидного бислоя мембран. Активация О. п. приводит к изменению структуры липопротеинов сыворотки крови и гиперхолестеринемии, нарушает разнообразные процессы клеточного метаболизма практически на всех уровнях.

Токсичными для организма являются не только образующиеся в результате О. п. перекиси, но и продукты более глубокого окисления липидов альдегиды, кислоты. Карбонильные продукты О. п. ингибируют ряд ферментов, подавляют ДНК, увеличивают капилляров, модифицируют агрегацию тромбоцитов и проявляют ряд других нежелательных эффектов. Инициирующие О. п. и возникающие в процессе окисления реактивные свободные радикалы вызывают структуры нуклеиновых кислот (Нуклеиновые кислоты), прежде всего ДНК, деструкцию нуклеотидных коферментов (Коферменты), нарушения функционирования ферментов (в первую очередь SH-ферментов), ковалентную модификацию различных биомолекул. Следствием избыточной генерации свободных радикалов могут быть патологические изменения свойств сосудов.

Для профилактики и терапии состояний, связанных с чрезмерной активацией О. п., могут быть использованы , вещества, специфически реагирующие с определенными свободными радикалами (ловушки или перехватчики), специфические вещества, образующие комплексные соединения с металлами переменной валентности, а также различные пути активации эндогенных систем антирадикальной защиты организма (например, постепенная к гипоксии или другим факторам).

В связи с важной ролью О. п. в патогенезе различных заболеваний определение продуктов этого процесса (главным образом конъюгированных диенов, малонового диальдегида), спонтанной и индуцированной хемилюминесценции в биологическом материале (сыворотке и плазме крови, эритроцитах, моче, конденсате выдыхаемого воздуха и т.д.) имеет все возрастающее диагностическое и прогностическое значение.

1. Малая медицинская энциклопедия. - М.: Медицинская энциклопедия. 1991-96 гг. 2. Первая медицинская помощь. - М.: Большая Российская Энциклопедия. 1994 г. 3. Энциклопедический словарь медицинских терминов. - М.: Советская энциклопедия. - 1982-1984 гг .

Смотреть что такое "Окисление перекисное" в других словарях:

перекисное окисление липидов - Процесс взаимодействия липидов (их ненасыщенных участков), входящих в состав клеточных мембран, с окисляющими агентами (анион О2 , радикал НО и др.), образующимися под действием ионизирующего облучения и в процессах метаболизма некоторых веществ; … Справочник технического переводчика

Механизм ПОЛ Перекисное окисление липидов (ПОЛ) окислительная деградация липидов, происходящая, в основном, под действием свободных радикалов. Одно из главных п … Википедия

Lipid peroxidation перекисное окисление липидов. Процесс взаимодействия липидов (их ненасыщенных участков), входящих в состав клеточных мембран, с окисляющими агентами (анион О2 , радикал НО и др.), образующимися под действием ионизирующего… … Молекулярная биология и генетика. Толковый словарь.

Совокупность процессов переваривания и всасывания нейтральных жиров (триглицеридов) и продуктов их распада в желудочно кишечном тракте, промежуточного обмена жиров и жирных кислот и выведение жиров, а также продуктов их обмена из организма.… … Медицинская энциклопедия - совокупность процессов всасывания, распределения, усвоения и выделения минеральных веществ, находящихся в организме преимущественно в виде неорганических соединений. Минеральные вещества играют главную роль в поддержании кислотно щелочного… … Медицинская энциклопедия

Механизм ПОЛ. Перекисное окисление липидов (ПОЛ) окислительная деградация липидов, происходящая, в основном, под действием свободных радикалов. Одно из главных последствий облучения. Один из продуктов этого процесса малондиальдегид. Литература Ю … Википедия

Молодые деревья в ботаническом саду … Википедия

- (синоним: нейтральные жиры, триглицериды) сложные эфиры трехатомного спирта глицерина и высших или средних жирных кислот, главная составная часть животных жиров и растительных масел, присутствуют во всех животных и растительных тканях, в питании… … Медицинская энциклопедия

Хаотропный эффект избытка жирных кислот и лизофосфатидов поддерживает активацию перекисного окисления липидов (ПОЛ) , инициируемого накоплением в гипоксической клетке активных форм кислорода (АФК). Генерация последних связана с Са 2+ - зависимым повреждением митохондрий и формированием избытка доноров электронов – восстановленных кофакторов.

Образование активных (токсичных) форм кислорода (в невозбужденном состоянии кислород нетоксичен) связано с особенностями его молекулярной структуры: О 2 содержит два неспаренных электрона с параллельными спинами, которые не могут образовывать термодинамически стабильную пару и располагаются на разных орбиталях. Каждая из этих орбиталей может принять еще один электрон. Таким образом, полное восстановление молекулы кислорода происходит в результате четырех одноэлектронных переносов:

Е - е - е - е - , Н +

О 2 О 2 - Н 2 О 2 `ОН + Н 2 О 2Н 2 О

Образующиеся в ходе неполного восстановления молекул кислорода супероксид (О 2 -), пероксид (Н 2 О 2) и гидроксильный радикал (`ОН) – активные формы кислорода , являются окислителями, что представляет серьезную опасность для многих структурных компонентов клетки (Авдеева Л.В., Павлова Н.А., Рубцова Г.В., 2005). Особенно активен гидроксильный радикал ( OH), взаимодействующий с большинством органических молекул. Он отнимает у них электрон и инициирует таким образом цепные реакции окисления.

Основной путь образования АФК в большинстве клеток – утечка электронов из цепи их передачи (дыхательной цепи) и непосредственное взаимодействие этих электронов с кислородом (Губарева Л.Е., 2005). В качестве еще двух источников могут выступать реакции с участиемоксидаз , использующих молекулярный кислород как акцептор электронов и восстанавливающих его до Н 2 О или Н 2 О 2 и реакции с участиемоксигеназ, включающих один (монооксигеназы) или два (диоксигеназы) атома кислорода в образующийся продукт реакции. В условиях дефицита в тканях кислорода, т.е. в ситуации, когда «спрос» (восстановленные кофакторы) превышает «предложение» (количество молекул кислорода), вероятность усиления образования АФК резко возрастает. Инициируемые ими свободнорадикальные реакции, приводят к повреждению клеточных и субклеточных структур, включая митохондрии, молекулы ДНК и белка. И хотя вклад АФК в развитие гипоксического некробиоза (в отличие от реперфузионного синдрома) расценивается в качестве доминирующего механизма не всеми авторами (Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П., 1999), тем не менее их участие в активации свободно-радикальных процессов в клетке, включая ПОЛ, является решающим.

Следует отметить, что ПОЛ представляя собой саморазвивающуюся цепную реакцию, постоянно протекает в клетке, играя роль необходимого звена в ее жизнедеятельности и в адаптационных реакциях. Благодаря перекисному окислению в молекуле фосфолипидов клеточных мембран, содержащих во втором положении жирную кислоту, появляются полярные гидроперекисные группировки (гидроперекиси липидов), обладающие детергентным действием. Появление таких группировок увеличивает подвижность полипептидных цепей, т.е. облегчает конформационные изменения молекул белков, что сопровождается ростом активности мембраносвязанных ферментов, к которым по существу относятся все ферментные системы клетки. И лишь чрезмерная активация ПОЛ, затрагивающая более 3-5% фосфолипидов мембран, превращает его из регуляторного механизма в звено патогенеза их повреждения при клеточной гибели (Ю.А. Владимиров, 1987; 2000).

В результате активации ПОЛ, инициируемого АФК, и прежде всего – гидроксильным радикалом ( OH), происходит образование новых вторичных радикалов: липидного (L ), алкоксильного (LO ), перекисного (LOO ). Рис. 28.

Рис. 28. Перекисное окисление липидов и образование вторичных радикалов

(Ю.А. Владимиров, 2001)

Химическая активность этих вторичных органических радикалов ниже, чем у гидроксильного радикала ( OH), но они активно вовлекаются в цепную реакцию ПОЛ, поддерживая и усугубляя повреждения липидного бислоя клеточных мембран.

Модифицирующие эффекты ПОЛ в отношении фосфолипидов определяют цепь дальнейших событий (Архипенко Ю.В. с соавт., 1983; Меерсон Ф.З., 1989; Владимиров Ю.А., 2001). Прежде всего, в молекулах фосфолипидов, содержащих во втором положении жирную кислоту, появляется полярная гидроперекисная группировка (рис. 29).

При этом накопление гидроперекисей липидов сопровождается уменьшением количества ненасыщенных липидов. При умеренной активации ПОЛ, как отмечалось выше, появление в микроокружении интегральных белков полярных продуктов ПОЛ, обладающих детергентным действием, вызывает увеличение подвижности полипептидной цепи, что, как правило, сопровождается увеличением каталитической активности ферментов. При избыточной активации ПОЛ главное значение приобретает уменьшение количества непредельных фосфолипидов.

Рис. 29. Образование гидроперекиси фосфолипида, начальный этап про­цесса ПОЛ

(Ф.З. Меерсон, 1984).

· Значительное уменьшение содержания непредельных фосфолипидов в мембране под влиянием ПОЛ, повышает регидность (микровязкость) ее липидного бислоя, что сопровождается снижением конформационной подвижности полипептидных цепей белков, встроенных в мембрану (эффект «вмораживания»). Поскольку такая подвижность необходима для нормального функционирования ферментов, рецепторов и каналоформеров, их функциональный ответ ингибируется (рис. 30).

Рис. 30 Изменение активности Са-АТФазы в мембранах саркоплазматического

ретикулума в результате модификации липидного окружения этого фер­мента

процессом ПОЛ (Ф.З. Меерсон, 1984)

А - исходное состояние; Б - умеренная активация Са-АТФазы; В - ингибирование-Са-АТФазы.

· Окисленные в ходе активации ПОЛ фосфолипиды подвергаются латеральной диффузии вдоль мембраны и образуют ассоциаты (кластеры), фиксированные взаимодействием фосфолипидов между собой и молекулами воды. Эти участки мембраны приобретают гидрофильность. Располагаясь друг против друга в каждом из монослоев липидного бислоя, такие ассоциаты образуют каналы в мембране, увеличивая ее проницаемость для воды, кальция и других ионов (рис. 31).

Рис. 31.Схема образования перекисных кластеров и фрагментация мембраны при индукции перекисного окисления липидов (Ф.З. Меерсон, 1984)

Светлый треугольник - гидроперекисная группа.

· Образующиеся продукты распада гидроперекисей фосфолипидов (малоновый, глутаровый и др. диальдегиды) взаимодействуют со свободными аминогруппами мембранных белков, образуя межмолекулярные сшивки и инактивируя эти белки (рис. 32). In vivo этот процесс приводит к образованию т.н. оснований Шиффа пигмента изнашивания липофусцина.

Рис. 32. Образование сшивок и ингибирование мембранных белков-ферментов в результате активации ПОЛ (Ф.З. Меерсон, 1984)

Последний представляет собой смесь липидов и белков, связанных между собой поперечными ковалентными связями и денатурированными в результате взаимодействия с химически активными группами (диальдегидами) продуктов ПОЛ. Этот пигмент фагоцитируется, но не гидролизуется ферментами лизосом, и поэтому накапливается в клетках в виде пигментных пятен, особенно на дорзальной поверхности ладоней у пожилых людей.

Гидроперекись (2), образовавшаяся в результате реакции фосфолипидов (1) с молекулярным кислородом, распадается на фосфолипид с укороченной углеводородной цепью во втором положении, сходный с лизофосфолипидами (3) и короткий углеводородный фрагмент – диальдегид (4). Взаимодействие бифункциональной по своей природе молекулы диальдегида с аминогруппами одновременно двух молекул белков приводит к формированию сшивки (5).

· Под влиянием ПОЛ происходит окисление сульфгидрильных (-SH) групп мембранных белков: ферментов, ионных каналов и насосов, что приводит к падению их активности.

· Образование полярных продуктов окисления способствует возрастанию на мембране отрицательного поверхностного заряда, обусловливающего фиксацию на ней полиэлектролитов. Среди последних – некоторые белки и пептиды, формирующие белковые поры – один из факторов снижения электрической стабильности мембран.

· Увеличение полярности внутренней оболочки мембраны обусловливает проникновение воды в липидный бислой – т.н. «водную коррозию мембраны».

· «Выталкивание» из мембраны части окислившихся полиненасыщенных жирных кислот приводит к уменьшению площади ее липидного бислоя.

Таким образом, на этом этапе развития гипоксического повреждения клеток ключевым звеном патогенеза выступает дезорганизация липидного бислоя мембран, осуществляемая при участии ионов кальция и липидной триады: активации липаз и фосфолипаз; детергентного действия избытка жирных кислот и лизофосфолипидов, а также активации перекисного окисления липидов.

Существенный вклад в эту дезорганизацию вносят также: механическое (осмотическое) растяжение мембран и адсорбция на липидном бислое полиэлектролитов , способствующие увеличению их порозности. В совокупности указанные нарушения обусловливают снижение электрической прочности мембран и возникновение электрического пробоя липидного бислоя собственным мембранным потенциалом (рис. 33). Последний рассматривается как терминальный механизм нарушения барьерной функции мембраны (Владимиров Ю.А., 2001).

Этот этап патогенетической цепи повреждения клеток при гипоксии, характеризующийся нарастающей утратой барьерной и матричной функций мембран , определяет переход обратимых изменений в клетке – в необратимые .

Последующее развитие событий связано с формированием повреждений клеточных структур, непосредственно приводящих к клеточной гибели. Существенно, что механизмы этих повреждающих эффектов также тесно связаны с повышенным содержанием в цитозоле ионов Са 2+ .

Патогенетические последствия избытка ионов кальция в заключительной стадии гипоксического повреждения клеток (стадия некробиоза) не ограничиваются активацией липаз и фосфолипаз. Ионы Са 2+ прямо участвуют в прямых эффектах повреждения клеточных структур и апоптотической гибели клеток. К числу этих эффектов относятся:

· Разрушение цитоскелета, которое связано с Са 2+ -зависимой активацией кальпаинов. Происходит деструкция некоторых белков цитоплазмы (β-актин, фодрин), что вызывает деформацию клеток, ограничивающую возможность их взаимодействия с микроокружением, а также способность к восприятию регуляторных сигналов. Слабость цитоскелета способствует дезинтеграции некоторых надмолекулярных комплексов в клетке, в частности, отсоединению рибосом от мембран шероховатого эндоплазматического ретикулума. В результате происходит насыщение цитоплазмы белковыми молекулами, подвергающихся деградации.

· Механическое повреждение клеточных структур, обусловленное Са 2+ активацией сократительной функции миофибрилл с одновременной утратой ими способности к расслаблению. Такие контрактурные сокращения сопровождаются механическим повреждением сократительных структур клетки.

· Омыление и эндогенный детергентный эффект. Накопление в клетке жирных кислот в присутствии избытка ионов Са 2+ (и Na +) приводит к образованию мыл – солей высших жирных кислот. По этой причине гидролиз сложноэфирных связей называется омылением . Образование мыл в цитозоле резко увеличивает его детергентную активность которая в буквальном смысле растворяет липидные мембраны (Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П., 1999). Мыла, разрушая мембраны органоидов, обрушивают на клетку удар гидролаз, активных радикалов и других метаболитов, которые до этого момента были изолированы в различных отсеках клетки. Этот эндогенный эффект имеет решающее значение в формировании финальной стадии клеточной гибели.

· Наряду с участием в некробиозе, ионы кальция участвуют в реализации механизмов апоптотической гибели клеток. Среди последних: повышение активности Са 2+ -зависимых эндонуклеаз и кальпаинов. Подобная активация несет в себе угрозу для клетки, инициируя ее апоптотическую гибель либо вследствие фрагментации ДНК (эндонуклеазами ), либо в результате протеолиза антиапоптотических белков (bcl-2) кальпаинами . Апоптозу может способствовать и кальпаининдуцированная деградация протеинкиназы С(ПКС), реализующую, в основном, антиапоптотические эффекты и повышающую устойчивость клеток к токсическим продуктам обмена.

· Более того, избыток ионов Са 2+ сам способствует образованию токсических продуктов, в роли которых могут, в частности, выступать молекулы оксида азота в высоких концентрациях, создаваемых Са 2+ -активацией индуцибельной NO-синтазы. Наиболее ярко такой эффект проявляется при т.н. глутаматной гибели нейронов , возникающей при гипоксии (ишемии мозга). Инициация развития событий в этом случае связана с дефицитом энергии в нейронах, выходом ионов калия, деполяризацией мембран и повышением внутриклеточного пула Са 2+ в результате длительного открытия потенциал зависимых кальциевых каналов (рис. 34).

Рис. 34. Механизм развития глутаматной гибели нейронов при гипоксии

Следствием избытка ионов кальция в цитоплазме является повышенное выделение нейромедиатора (глутамата) глутаматергическими нейронами в синаптическую щель. Восприятие данного сигнала постсинаптическими нейронами осуществляется с помощью НМДА-рецепторов (наиболее хорошо изученный подтип рецепторов глутамата с высоким сродством к синтетической аминокислоте Н-метил-Д-аспартату), чувствительность которых к медиатору в условиях гипоксии значительно возрастает (Крыжановский Г.Н., 1997). Результатом «глутаматной бомбардировки» (Акмаев И.Г., 1996; Акмаев И.Г., Гриневич В.В., 2001) постсинаптического нейрона является открытие в нем ионных каналов, приводящее к увеличению поступления кальция в клетку и активация нейрональной NO-синтазы (NOS). Продуцируемый под ее влиянием оксид азота, имея малый размер и липофильную природу молекулы, диффундирует во внеклеточное пространство и поступает через мембраны в близлежащие клетки (нейроны), оказывая на них токсическое влияние. Основу этого токсического влияния составляет энергетический дефицит клеток. Механизм формирования такого дефицита связан со способностью NO вызывать S-нитрозилирование клеточных железосодержащих белков (аконитаза ЦТК, комплексы I-III цепи переноса электронов в МТХ) и их инактивацию. Кроме того, под влиянием NO происходит рибозилирование и нитрозилирование глицеральдегид-3-фосфатдегидро-геназы , обусловливающей торможение гликолиза. Наконец, при взаимодействии NO с другим радикалом – О 2 - образуется пероксинитрит-анион (ONOO -), вызывающий необратимое ингибирование железосодержащих белков.

За счет образования ONOO - возможно включение апоптотического механизма гибели клеток путем реализации следующего каскада:

Особенностью глутаматной гибели нейронов является отсутствие гибели самих NO-продуцирующих нейронов, оказывающихся защищенными от токсического действия NO. Механизм этой защиты связывают с активацией супероксиддисмутазы (СОД) и (или) с переходом NO в окисленную форму (NO +). По сути здесь прослеживается прямая аналогия с макрофагами, которые, продуцируя NO, сами проявляют к нему устойчивость.

Таким образом, гибель клетки при гипоксии представляет собой закономерное развертывание цепи событий, включающих формирование энергодефицита, ингибирование основных метаболических путей, активацию липидной триады и последующее необратимое повреждение клеточных структур. Центральным звеном патогенеза этих событий является повышение внутриклеточной концентрации ионов кальция, а главной мишенью – клеточные мембраны и, прежде всего – митохондрии.

Последовательность рассмотренных изменений при гипоксии (аноксии) одинакова для самых различных тканей. Об этом свидетельствуют опыты со срезами тканей, изолированными клетками и изолированными органеллами (Владимиров Ю.А., 2001). Рис. 35.

Различие состоит лишь в скорости протекания этих процессов, которая при температуре тела человека в 2-3 раза выше. Кроме того, эта скорость различна для разных тканей и с наибольшей быстротой указанные процессы протекают в ткани мозга, с меньшей – в печени, с еще более низкой скоростью – в мышечной ткани.

Рис. 35. Последовательность нарушений в клетках печени при аноксии

по Ю.А. Владимирову, 2001

XIV. ГИПЕРОКСИЯ

Гипероксия – повышенное поступление кислорода в организм . В отличие от гипоксии, гипероксия всегда носит экзогенный характер и в естественных условиях практически не встречается. В связи с этим, адаптивные механизмы к данному состоянию эффективны лишь в условиях относительно невысокой кислородной нагрузки, определяемой величиной парциального давления кислорода и продолжительностью его действия. Примером такой зависимости может служить кривая безопасных сроков дыхания кислородом человека (рис. 36).

Рис. 36.Граница действия кислорода на человека (по Hartmann, 1966).

Цитируется по А.Г. Жиронкину (1979).

По оси абсцисс - длительность дыхания кислородом, часы; по оси ординат - парциальное дав­ление кислорода, атм.

Как видно из рисунка, зона т.н. «физиологического действия кислорода» наиболее продолжительна при небольших значениях его парциального давления (около 0,5 атм.), когда защитно-приспособительные реакции в состоянии обеспечить сохранение нормального напряжения кислорода в тканях. Основу этих реакций составляют механизмы, направленные на ограничение поступления и транспорта кислорода. На это, в частности, направлена первичная реакция системы внешнего дыхания, в виде снижения легочной вентиляции и показателя минутного объема дыхания.

Данные сдвиги являются следствием прекращения в условиях повышенного поступления кислорода нормальной естественной импульсации с артериальных хеморецепторов. Вместе с тем, ограничение вентиляции не только снижает поступление кислорода в организм, но и приводит к развитию гиперкапнии. Последняя определяет вторую фазу реакции системы дыхания, характеризующуюся усилением вентиляции, направленным на снижение РаСО 2 и ликвидацию газового ацидоза. Важнейшим сдвигом со стороны системы кровообращения при гипероксии является закономерное сужение мелких кровеносных сосудов, сопровождающееся ростом периферического сопротивления, замедлением общего и локального кровотока, повышением диастолического давления. Еще одним проявлением реакции со стороны этой системы служит брадикардия, регистрируемая до появления признаков кислородного отравления. Изменения со стороны системы крови в ответ на гипероксию проявляются в начальный период преходящей эритропенией и снижением уровня гемоглобина, что обусловлено перемещением тканевой жидкости в кровь и депонированием эритроцитов (Жиронкин А.Г., 1979).

При возрастании парциального давления кислорода во вдыхаемой газовой смеси, на первый план выступает его токсическое действие, поскольку защитный эффект приспособительных реакций минимизируется. В этой зоне кислород уже играет роль фактора не обеспечивающего, а угнетающего окислительные процессы в тканях. Что касается механизмов самого токсического влияния, то сегодня наиболее принятой является точка зрения R. Gershman (1964), связывающего этот механизм с образованием активных форм кислорода и с активацией свободнорадикального окисления.

В условиях перенасыщения тканей кислородом, т.е. в ситуации, когда «предложение» (избыток кислорода) превышает «спрос» (количество восстановленных кофакторов, подлежащих окислению), вероятность повышенного образования АФК возрастает. Соответственно, усиливается свободнорадикальное окисление, сопровождающееся повреждением клеточных и субклеточных структур, и, прежде всего, митохондрий.

Очевидно, что дезорганизация и повреждение митохондрий будут сопровождаться нарушением цепи транспорта электронов и окислительного фосфорилирования. Т.е. нарушениями, определяющими суть понятия «гипоксия». Соответственно, такое состояние называется гипероксической гипоксией.

Повреждение клеточных и субклеточных структур при активации свободнорадикальных процессов, приводит к развитию многочисленных нарушений специфических функций различных органов и систем. Так, ингибирование ферментов в головном мозге снижает продукцию γ-аминомасляной кислоты – важнейшего тормозного медиатора, что служит одним из механизмов развития при гипероксии судорожного синдрома кортикального генеза . Нарушение продукции сурфактанта легочным эпителием обусловливает резкое уменьшение компенсаторных резервов системы внешнего дыхания, повышая поверхностное натяжение альвеол, и способствуют появлению микроателектазов . В тяжелых случаях нарушение продукции сурфактанта может сопровождаться отеком легких . У некоторых детей первого года жизни дыхание чистым кислородом приводит к развитию респираторного дистресса – бронхопульмональной дисплазии (Маляренко Ю.Е., Пятин В.Ф., 1998). Активация свободнорадикального окисления при гипероксигенации лежит в основе формирования дефектов зрения у маленьких детей, в связи с нарушением созревания фоторецепторов.

Наряду с АФК токсическое действие кислорода опосредуется и чрезмерным напряжением некоторых защитно-приспособительных реакций. К числу таких реакций, в частности, относится длительный спазм сосудов (реакция на гипероксию). У недоношенных детей он способствует развитию ретролентальной фиброплазии (образованию фиброзной ткани за хрусталиком), приводящей к слепоте. Аналогичный спазм сосудов в легких обусловливает легочную гипертензию, расстройства микроциркуляции и повреждение легочного эпителия – нарушений, предрасполагающих к развитию воспаления .

Указанные обстоятельства заставляют ограничивать применение кислорода для лечебных целей, при которых РО 2 не должен превышать 380 мм рт. ст. (Березовский В.А., 1975).

Особую чувствительность к токсическому действию избытка кислорода проявляет ткань мозга плода , которая характеризуется значительно более низким напряжением кислорода, чем церебральные структуры зрелого организма . «Этот факт не является результатом несовершенства процессов кислородного снабжения организма во внутриутробном периоде, а напротив, отражает сбалансированность этих процессов, обеспечивающих, с одной стороны, адекватную оксигенацию мозга, а с другой - защиту его от избыточного потока О 2 » (Рагузин А.В., 1990). Экспериментально установлено, что напряжение кислорода тканей фетального мозга является относительно стабильным параметром гомеостаза внутриутробно развивающегося организма, который мало меняется даже при значительных сдвигах кислородного режима беременных животных . Такое постоянство РО 2 тканей мозга плода при сдвигах РаО 2 (от 50 до 370 мм рт. ст.) материнского организма определяется механизмами, локализованными прежде всего в маточно-плацентарной области, но не системными реакциями дыхания и кровообращения. К рождению формирование механизмов стабилизации кислородного гомеостаза мозга не завершено, что служит причиной более значимого (чем у взрослых) увеличения РО 2 церебральных структур новорожденных при ингаляции чистым кислородом. Подобный прирост РО 2 сопровождается активацией свободнорадикального окисления в ткани мозга и развитием негативных качественных изменений параметров условно оборонительных рефлексов в зрелом возрасте (Рагузин А.В., 1990). В связи с данным положением обосновывается подход к коррекции тяжелой степени гипоксии новорожденных с использованием для ингаляции не чистого кислорода, а газовых смесей с его пониженным содержанием.

Судорожная форма кислородного отравления возникает при остром отравлении кислородом и известна с конца XIX столетия как симптом Бэра , впервые обнаруженный и описанный этим автором. Судороги возникают, как правило, при дыхании кислородом под давлением, превышающим 3-4 атм. и очень напоминают по своему течению эпилептические судорожные припадки.

Клинически различают три стадии этого процесса (Черешнев В.А., Юшков Б.Г., 2001):

I стадия – учащение дыхания и сердцебиения, повышение артериаль­ного давления, расширение зрачков, усиление активности с отдельными по­дергиваниями мышц.

II стадия – стадия судорог, похожих на эпилептические с клоническими и тоническими проявлениями.

III стадия – терминальная – ослабление судорог с расстройством ды­хания, которое переходит на отдельные вдохи. Смерть наступает от парали­ча дыхательного центра.

В числе продуктов этого процесса - малондиальдегид и 4-гидроксиноненал.

Реакции биологического окисления сопровождаются образованием свободных радикалов, частиц, имеющих на внешней орбите неспаренный электрон. Это обусловливает высокую химическую активность этих радикалов. Например, они вступают в реакцию с ненасыщенными жирными кислотами мембран, нарушая их структуру. Антиоксиданты предотвращают свободнорадикальное окисление.

Через стадию перекисных производных ненасыщенных жирных кислот осуществляется биосинтез простагландинов и лейкотриенов, а тромбоксаны, оказывающие мощное влияние на адгезивно-агрегационные свойства форменных элементов крови и микроциркуляцию, сами являются гидроперекисями. Образование гидроперекисей холестерина - одно из звеньев в синтезе некоторых стероидных гормонов, в частности, прогестерона.

Литература

• Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. - М.: Наука, 1972. - 252 с.
• Барабой В. А., Орел В.Э., Карнаух И.М. Перекисное окисление и радиация. - К.: Наукова Думка, 1991.
• Ковшевный В. В. - свободнорадикальное окисление

Примечания

Wikimedia Foundation . 2010 .

Смотреть что такое "Перекисное окисление липидов" в других словарях:

перекисное окисление липидов - Процесс взаимодействия липидов (их ненасыщенных участков), входящих в состав клеточных мембран, с окисляющими агентами (анион О2 , радикал НО и др.), образующимися под действием ионизирующего облучения и в процессах метаболизма некоторых веществ; … Справочник технического переводчика

Lipid peroxidation перекисное окисление липидов. Процесс взаимодействия липидов (их ненасыщенных участков), входящих в состав клеточных мембран, с окисляющими агентами (анион О2 , радикал НО и др.), образующимися под действием ионизирующего… … Молекулярная биология и генетика. Толковый словарь.

Сложный многостадийный цепной процесс окисления кислородом липидных субстратов, главным образом полиненасыщенных жирных кислот, включающий стадии взаимодействия липидов со свободнорадильными соединениями и образования свободных радикалов липидной … Медицинская энциклопедия

Механизм ПОЛ. Перекисное окисление липидов (ПОЛ) окислительная деградация липидов, происходящая, в основном, под действием свободных радикалов. Одно из главных последствий облучения. Один из продуктов этого процесса малондиальдегид. Литература Ю … Википедия

При сахарном диабете в организме развивается недостаток витаминов и минеральных веществ. Это обусловлено тремя причинами: ограничением рациона, нарушением обмена веществ и снижением усвоения полезных веществ. В свою очередь, дефицит витаминов и… … Википедия

- (Dibunolum) (см. также токоферола ацетат). 2,6 Ди трет бутил 4 метилфенол. Синонимы: Бутилокситолуол, Ионол. Белый или белый со слегка желтоватым оттенком кристаллический порошок. Практически нерастворим в воде, легко растворим в спирте.… …

ДИБУНОЛ (Dibunolum) (см. также токоферола ацетат). 2,6 Ди трет бутил 4 метилфенол. Синонимы: Бутилокситолуол, Ионол. Белый или белый со слегка желтоватым оттенком кристаллический порошок. Практически нерастворим в воде, легко растворим в спирте … Словарь медицинских препаратов

I Жирные кислоты карбоновые кислоты; в организме животных и в растениях свободные и входящие в состав липидов жирные кислоты выполняют энергетическую и пластическую функции. Ж. к. в составе фосфолипидов участвуют в построении биологических… … Медицинская энциклопедия

Атомы или группы химически связанных атомов, обладающие свободными валентностями, т.е. неспаренными (нескомпенсированными) электронами на внешней (валентной) орбитали. Наличие неспаренных электронов определяет высокую химическую реакционную… … Медицинская энциклопедия

Действующее вещество ›› Аминокислоты для парентерального питания+Прочие препараты [Жировые эмульсии для парентерального питания + Декстроза + Минеральные соли] (Aminoacids for parenteral nutrition+Other medicines }

Напечатать