Методики визначення антиоксидантної активності жиророзчинних компонентів. Хемілюмінесцентний метод визначення антиоксидантів (АТ)

дипломна робота

1.4 Методи дослідження антиоксидантів

антиоксидантної активності класифікуються: за способами реєстрації АОА, що проявляється (волюмометричні, фотометричні, хемілюмінесцентні, флуоресцентні, електрохімічні); за типом джерела окислення; за типом окислюваної сполуки; за способом вимірювання окисленої сполуки.

Однак найбільш відомими методами визначення антиоксидантної активності є:

1 TEAC (trolox equivalent antioxidant capacity): метод заснований на наступній реакції:

Метміоглобін + Н 2 Про 2 >Феррілглобін +ABTS>ABTS*+АТ.

Метод визначення еквівалентів Тролоксу (TEAC) заснований на здатності антиоксидантів відновлювати радикальні катіони 2,2-азинобісу (ABTS) і тим самим інгібувати поглинання в довгохвильовій частині спектру (600 нм). Істотним недоліком методу є двоступінчаста реакція одержання радикалу. Це подовжує час проведення аналізу та може збільшити розкид результатів, незважаючи на те, що для аналізу використовують стандартизований набір реактивів.

2 FRAP (ferric reducing antioxidant power): метод заснований на наступній реакції:

Fe(III)-Трипіридитріазин+АТ>Fe(II)-Трипіриділтріазин.

Залізовідновлююча/антиоксидантна здатність (FRAP). Тут використовується реакція відновлення Fe(III)-трипіридилтріазину до Fe(II)-трипіридилтриазину. Однак цим методом неможливе визначення деяких антиоксидантів, наприклад глутатіону. Цей метод дозволяє пряме визначення низькомолекулярних антиоксидантів. При низьких рН відновлення Fe(III)-трипіридилтріазинового комплексу в Fe(II)-комплекс супроводжується появою інтенсивно блакитного забарвлення. Вимірювання засновані на здатності антиоксидантів пригнічувати окисний ефект реакційних частинок, що генеруються в реакційній суміші. Цей метод відрізняється простотою, швидкістю та невеликими витратами при виконанні.

3 ORAC (oxygen radical absorbance capacity): метод заснований на наступній реакції:

Fe(II)+H 2 O 2 >Fe(III) + OH*+AO>OH* + Люмінол.

Визначає здатність абсорбувати кисневі радикали (ORAC). У цьому методі реєструють флуоресценцію субстрату (фікоеритрину або флуоресцеїну), яка виникає внаслідок його взаємодії з АФК. Якщо в досліджуваному зразку є антиоксиданти, спостерігають зменшення флуоресценції в порівнянні з контрольним зразком . Спочатку цей метод був розроблений доктором Гохуа Као в Національному інституті старіння в 1992 р. В 1996 доктор Као об'єднався з доктором Рональдом Прайером в спільну групу в Дослідницькому центрі старіння USDA, де був створений напівавтоматичний метод.

4 TRAP (total radical trapping antioxidant parameter): метод заснований на наступній реакції:

AAPH+AO>AAPH* + ФО (ФЕ).

У цьому методі використовують здатність антиоксидантів взаємодіяти з пероксильним радикалом 2,2-азобіс(2-амідинопропан) дигідрохлорид (ААРН). Модифікації TRAP полягають у способах реєстрації аналітичного сигналу. Найчастіше на завершальній стадії аналізу перокси-радикал ААРН взаємодіє з люмінісцентним (люмінол), флуоресцентним (дихлорфлюоресцин-діацетат, DCFH-DA) або іншим оптично активним субстратом.

Як стандарт для методів TEAC, ORAC і TRAP використовують водорозчинне похідне вітаміну Е - Trolox (6-гідрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбокси кислоту).

Останнім часом з метою оцінки антиоксидантної активності зріс інтерес застосування електрохімічних методів. Ці методи мають високу чутливість, швидкість аналізу.

Оцінку антиоксидантної активності деяких харчових продуктів проводять методом потенціометрії, заснованому на використання властивості речовин-антиоксидантів брати участь в окисно-відновних реакціях за рахунок єнольних (ОН) і сульфгідрильних (SH) груп.

Визначення антиоксидантних властивостей розчинів засноване на хімічній взаємодії антиоксидантів з медіаторною системою, що призводить до зміни її окисно-відновного потенціалу. Електрохімічний осередок є ємністю, що містить K-Na-фостфатний буферний розчин, медіаторну систему Fe(III)/Fe(II) і комплексний електрод до вимірювання окисно-відновного потенціалу. Антиоксидантну активність оцінюють у г-екв/л.

Амперометричний метод визначення антиоксидантної активності заснований на вимірюванні електричного струму, що виникає при окисленні досліджуваної речовини на поверхні робочого електрода, що знаходиться під певним потенціалом. Чутливість амперометричного способу визначається як природою робочого електрода, і потенціалом, прикладеному щодо нього. Межа виявлення амперометричного детектора поліфенолів, флавоноїдів на рівні нано-пікограмів, при таких малих концентраціях менша ймовірність взаємного впливу різних антиоксидантів за їхньої спільної присутності, зокрема прояв явища синергізму. До недоліків способу можна віднести його специфічність: у цих умовах не можуть бути проаналізовані антиоксиданти, які самі окислюються або відновлюються в галузі потенціалів відновлення кисню. До переваг способу можна віднести його експресність, простату і чутливість.

Метод гальваностатичної кулонометрії за допомогою електрогенерованих окислювачів - метод застосовний для аналізу жиророзчинних антиоксидантів.

Розроблено різні способи визначення аскорбінової кислоти:

амперометричний спосіб з використанням алюмінієвого електрода, модифікованого плівкою гексаціаноферату нікелю (II), методом простого занурення в розчин;

спосіб твердофазно-спектрофотометричного та візуального тест-визначення аскорбінової кислоти з використанням як індикаторного порошку ксерогелю кремнієвої кислоти, модифікованого реактивом Вавелі та міддю (II);

хемілюмінесцентне визначення аскорбінової кислоти можна провести проточно-інжекційним методом з хемілюмінесцентної реакції родаміну В з церієм (IV) у сірчанокислому середовищі.

визначення аскорбінової кислоти в діапазоні 10 -8 -10 -3 г/см 3 методом анодної вольтамперометрії у водних та водно-органічних середовищах.

Найбільш поширеним є метод FRAP, оскільки він експресний, високочутливий. За останні кілька десятиліть було розроблено велику кількість різновидів методик визначення антиоксидантної активності методом FRAP (таблиця 1).

Таблиця 1 Розвиток методу FRAP та його застосування для визначення антиоксидантної активності різних об'єктів

				Об'єкти аналізу	Примітки
				Плазма крові	t=4хв. Вивчено стехіометрію реакції та адитивність.
				Чай, вино	Визначення АОА, обумовленої поліфенолами
					Порівняно значення АОА різних сортів чаю
Pulido, Bravo, Saura-Calixto				Модельні розчини	t=30хв. Виявлено вплив неводного розчинника
				Рослини
				Кров, тканини	Метод ПІА. Перевірено вплив сторонніх речовин.
Firuzi,Lacanna, Petrucci e.a.				Модельні розчини	Вивчено чутливість визначення різних АТ як функція їх структури та редокс-потенціалу.
Katalinic, Milos,				Різні вина
Темердашев, Цюпко та ін.				Модельні суміші
Логінова, Коновалова				ліки. Препарати	Тест-метод
Темердашев, Цюпко та ін.				Червоні сухі вина	Кореляція АОА з іншими показниками якості вин
Продовження таблиці 1
				Модельні суміші	Вивчено чутливість визначення різних АТ
Вершинін, Власова, Цюпко				Модельні суміші	Виявлено неадитивність сигналу при нестачі окислювача
Анісімович, Дейнека та ін.				Модельні розчини	Запропоновано кінетичні параметри оцінки АОА.

Примітки: умовно позначено: ПІА-проточно-інжекційний аналіз, TPTZ-трипіридилтріазин, DIP-2,2,-дипіридил, PHEN-о-фенантролін, DPA-піридиндикарбонова кислота, FZ-ферозин, АК-аскорбінова кислота, КТ-катехол -час експозиції, хв.

Взаємодія між білками та поліелектролітами у водних розчинах

Для характеристики білок-поліелектролітних комплексів використовують різні методи аналізу. Інструментальні методи дають інформацію щодо структурних та оптичних властивостей, а також визначають динаміку та характер зв'язування ПЕК.

Вплив сполук d-металів на швидкість дисоціації молекули води у біполярній мембрані

У процесі синтезу нових БПМ велика увага має бути приділена дослідженню властивостей отриманих зразків для подальшого вибору умов синтезу, що забезпечують поліпшення електрохімічних характеристик мембран, що синтезуються.

Дизайнерські наркотики та синтетичні канабіноїди

Виявлення синтетичних каннабіноїдів у рослинних сумішах може бути здійснено різними фізико-хімічними методами, такими як хромато-мас-спектрометрія, газова, тонкошарова та високоефективна рідинна хроматографії.

Розробка методики визначення флавоноїдів у лікарській рослинній сировині

Синтез та фармакологічні властивості хінолінонів-2

Об'єкт дослідження: Хінолінон-2. Метод дослідження: За допомогою комп'ютерної програми Marvin JS, була створена структура речовини. Далі її відправили сайт «http://www.way2drug.com/PASSOnline/predict.php» для подальшого дослідження...

Термоспектральний метод дослідження продуктів випаровування епоксидного полімеру

Технологія отримання високоочищеного хітозану з ракоподібних панцирів

Визначення молекулярної маси хітозану Молекулярну масу хітозану визначали віскозиметрично за стандартною методикою. Розчини концентрації 0,05 та 0,5 г/дл готували розчиненням навішування порошку полімеру в ацетатному буфері (0...

Фізико-географічна характеристика території природного парку

Винахід відноситься до харчової промисловості і може бути використане щодо сумарної антиоксидантної активності. Спосіб здійснюють наступним чином: аналіт взаємодіє з реагентом 0,006 М Fe(III) - 0,01 М-фенантролін. Аскорбінова кислота (АК) взаємодіє з таким самим реагентом, який додають у співвідношенні 1:100. Далі інкубують щонайменше 90 хв і фотометрируют при 510±20 нм. Після цього встановлюють залежність величини аналітичного сигналу кількості речовини і розраховують величину сумарної АОА. Представлений спосіб дозволяє менш трудомістко і достовірно визначати сумарну антиоксидантну активність рослинної сировини та харчових продуктів на його основі. 2 з.п. ф-ли, 1 іл., 5 табл.

Винахід відноситься до аналітичної хімії і може бути використане для визначення сумарної антиоксидантної активності (АОА) рослинної сировини та харчових продуктів на його основі.

Відомий кулонометричний спосіб визначення сумарної АОА чаю, заснований на взаємодії водних екстрактів продукту з електрогенерованих сполуками брому (І.Ф.Абдулін, Е.М.Турова, Г.К.Будников Кулонометрична оцінка антиоксидантної здатності екстрактів чаю електрогенерованим бромом // Журн. хімії 2001. Т.56., № 6. С.627-629). Вибір як титрант електрогенерованих сполук брому обумовлений їх здатністю вступати в різні реакції: радикальні, окислювально-відновні, електрофільного заміщення та приєднання по кратних зв'язках. Це дозволяє охопити широке коло біологічно активних сполук чаю, що мають антиоксидантні властивості. Недоліками способу є можливість протікання реакції бромування з речовинами, що не є антиоксидантами, і вираз сумарної АОА, що отримується, в одиницях кількості електрики (кКл/100 г), що ускладнює оцінку одержуваних результатів.

Відомий вольтамперометричний спосіб визначення сумарної антиоксидантної активності щодо відносної зміни струму електровідновлення кисню в інтервалі потенціалів від 0,0 до -0,6 В (відн. насич. х.с.е.) на ртутно-плівковому електроді (Пат. 2224997, Росія, МПК 7 G 01 N 33/01 Вольтамперометричний спосіб визначення сумарної активності антиоксидантів / Короткова Є. І., Карбаїнов Ю. А. - № 2002115232/12; Недолік способу - у перебігу побічних електрохімічних реакцій, у яких знижується ефективність визначення антиоксидантів, що веде до зниження достовірності результатів.

Відомий спосіб контролю сумарної АОА профілактичних і лікувальних антиоксидантних засобів по перекисному окисленню ліпідів до малонового альдегіду з спектрофотометрічним або хемілюмінесцентним детектуванням (Пат. 2182706, Росія, МПК 7 G 01 N 33/5. бних антиоксидантних коштів / Павлюченко І.І., Басов А.А., Федосов С.Р. - № 2001101389/14;заяв.15.01.2001; опубл.20.05.2002). При цьому антиоксидантна активність обернено пропорційна рівню продуктів перекисного окислення ліпідів. Недоліком даного способу вважатимуться обмежений коло аналізованих об'єктів, оскільки у умовах визначаються антиоксиданти лише однієї групи - ліпіди.

Відомий спосіб визначення сумарної АОА екстракту рослин, що полягає в інкубації екстракту з лінетолом і сульфатом заліза (II), ініціювання реакції окислення УФ-опроміненням і подальшій взаємодії з тіобарбітурової кислоти в присутності тритону Х-100 (Заявка 97139 01 N 33/00 Спосіб визначення загальної антиокислювальної активності / Рогожин В. В. - Заявка 08.07.1997; При проведенні спектрофотометрування використовують суміш етанолу з хлороформом у співвідношенні 7:3. Значення АОА біологічного матеріалу визначають по відношенню накопичення продукту реакції - малонового діальдегіду в пробі, що містить екстракт до проби з прооксидантом. Недолік способу полягає у можливості протікання побічних реакцій при УФ-опроміненні, що знижує достовірність результатів аналізу.

Перелічені способи визначення сумарної АОА мають низку недоліків: висока трудомісткість, мала достовірність, виміряна величина сумарної АОА не віднесена і порівнянна з загальноприйнятим речовиною.

Найбільш близьким аналогом до винаходу є спосіб визначення сумарної АОА лікарських рослин вимірюванням хемілюмінесценції, що виникає при реакції з люмінолом у присутності окислювача пероксиду водню (М.Х.Навас, А.М.Хімінець, А.Г.Асуеро Визначення відновлювальної здатності настойок канаркового методом хемілюмінесценції // Журнал аналіт. хімії. 2004. Т.59. Для кількісної оцінки сумарної АОА порівнювали відновну здатність екстракту лікарської сировини та активність сильнодіючого антиоксиданту - аскорбінової кислоти у кількості 25-110 мкг. У порівнянні з перерахованими способами в прототипі як окислювач застосовують пероксид водню, що взаємодіє з широким колом антиоксидантів, і виміряна величина сумарної АОА об'єкта визначається і виражається щодо аскорбінової кислоти, що є загальноприйнятим антиоксидантом, що дозволяє отримувати достовірні результати при збереженні інших недоліків. До недоліків слід віднести і складність застосовуваного в способі обладнання.

Технічним завданням заявленого винаходу є розробка менш трудомісткого та достовірного способу визначення сумарної антиоксидантної активності рослинної сировини та харчових продуктів на його основі.

Для вирішення технічного завдання пропонується взаємодія аналіту з реагентом 0,006 М Fe(III) - 0,01 М о-фенантролін, і аскорбінової кислоти (АК) з таким же реагентом, який додають у співвідношенні 1:100, інкубують не менше 90 хв, фотометрують при 510±20 нм з наступним встановленням залежності величини аналітичного сигналу кількості речовини і розрахунком величини сумарної АОА. Зокрема, розрахунок можна здійснити за формулою (I), виведеною з рівняння кількісної відповідності між об'єктом, що досліджується, і аскорбіновою кислотою:

де а, - коефіцієнти в рівнянні регресії для залежності аналітичного сигналу від кількості АК;

а", в" - коефіцієнти в рівнянні регресії залежно від аналітичного сигналу від кількості досліджуваного об'єкта;

х вос. - Маса досліджуваного відновника (зразка), мг.

Використання пропонованого реагенту в зазначених умовах дозволило розширити лінійний діапазон і знизити нижню межу визначених кількостей аскорбінової кислоти. Пропонована сукупність суттєвих ознак дозволяє визначати сумарну АОА широкого кола рослинної сировини та харчових продуктів на його основі.

Рівняння кількісної відповідності пов'язує залежність аналітичного сигналу від кількості аскорбінової кислоти та залежність аналітичного сигналу від кількості об'єкта, що досліджується, за умови рівної антиоксидантної активності.

Після обробки результатів фотометричних вимірювань величини аналітичного сигналу методом найменших квадратів (К.Дерффель Статистика в аналітичній хімії. - М.: «Мир», 1994. Хімія, 1984. С.137-144) зазначені залежності були описані лінійною регресійною функцією: y = ax + b де а - коефіцієнт регресії, b - вільний член. Коефіцієнт а в рівнянні регресії дорівнює тангенсу кута нахилу прямої до осі х; коефіцієнт b - відстані по осі від початку координат (0,0) до першої точки (x 1 , y 1).

Коефіцієнти а та b розраховуються за формулами:

Рівняння регресії для залежності АС від кількості аскорбінової кислоти в даний момент має вигляд:

у АК = а х АК (мг) + b,

рівняння регресії для залежності АС від кількості об'єкта (відновника), що досліджується:

у ВОСТ = а "х ВОСТ (мг) + b",

де у АК, у ВОСТ - оптична щільність фотометрованого розчину;

х АК (мг), х ВОСТ (мг) – концентрація аскорбінової кислоти (відновника) у розчині;

тоді, прирівнюючи значення функцій, отримуємо формулу (I) для розрахунку антиоксидантної активності об'єкта, що досліджується, в одиницях кількості (мг) аскорбінової кислоти.

На кресленні відбито залежність аналітичного сигналу від кількості відновника.

Вимір оптичної щільності аналізованих розчинів проводили на фотоелектроколориметр КФК-2МП.

Відомо (Ф.Умланд, А.Ясін, Д.Тірік, Г.Вюнш Комплексні сполуки в аналітичній хімії - М.: Світ, 1975. - 531 с.), що о-фенантролін утворює із залізом(II) розчинний у воді хелат червоно-жовтогарячого кольору, який характеризується максимумом поглинання при λ=512 нм. Тому в запропонованому способі фотометрування проводять при = 510±20 нм.

Оптимізацію складу реагенту та його кількості, що вводиться в реакцію, проводили на підставі результатів багатофакторного планування експерименту методом «Латинського квадрата», яке полягало в зміні в кожному досвіді всіх факторів, що вивчаються, причому кожен рівень кожного фактора тільки один раз зустрічається з різними рівнями інших факторів. Це дозволяє виділити і оцінити ефект, що викликається кожним фактором, що вивчається окремо.

Як фактори виступали: кількості Fe(III), о-фенантроліну та обсяг реагенту, що вводиться в реакцію. Сукупність факторів повинна забезпечувати широкий діапазон лінійності аналітичного сигналу (АС) за достатньої чутливості, з одного боку, та стійкості реагенту в часі, з іншого. Це дозволило кожному за чинника виділити такі рівні:

кількість Fe(III): 0,003 М (A 1); 0,006 М (А2); 0,009 М (А 3);

кількість о-фенантроліну: 0,01 M (B 1); 0,02 М (2); 0,03 М (3);

об'єм реагенту: 0,5 мл (C 1); 1,0 мл (2); 2,0 мл (3) (таблиця 1).

Для вибору оптимальної комбінації рівнів факторів отримували градуювальні залежності АС від кількості аскорбінової кислоти в діапазоні від 10 до 150 мкг (що необхідно для підтвердження лінійності функції), розраховували рівняння регресії отриманої залежності, а потім величину АС при заданій кількості (120 мкг) аскор. Таким чином, для кожного складу реагенту (фактори А, В) було підібрано обсяг (фактор С), при якому значення АС максимально. Це дозволило скоротити кількість аналізованих комбінацій до дев'яти (таблиця 2).

Порівнюючи, сумарний АС для кожного рівня виділили суми, що мають максимальне значення: A 2 (0,991); ΣB 1 (1,066); ∑C 2 (1,361). Це дозволило зробити висновок, що оптимальним є реагент складу: 0,006 М Fe(III) - 0,01 М-фенантроліну при його об'ємі, що вводиться в реакцію, 1,0 мл на 100 мл розчину.

При оптимальній концентрації реагенту вивчили зміну залежності АС від концентрації аскорбінової кислоти та деяких відновників, поширених у природних об'єктах (танін, рутин, кверцетин), за різного часу інкубування реакційної суміші (30, 60, 90, 120 хв). Було встановлено, що для всіх відновників, що вивчаються, залежність АС від їх вмісту лінійна в діапазоні 10-150 мкг (див. креслення) і величина АС залежить від часу інкубування (таблиця 3).

З креслення видно, зміна АС під впливом рутина незначно, таніну наближається, а кверцетину перевищує аналогічну залежність для аскорбінової кислоти. При розгляді зміни АС від часу інкубування для всіх відновників, що вивчаються (таблиця 3) встановлено, що стабілізація аналітичного сигналу в часі спостерігається від 90 хвилин.

Таблиця 3 Зміна АС відновників у часі
Досліджувана речовина	m речовини, мг/см 3	Аналітичний сигнал
		Час інкубування реакційної суміші, хв
30	60	90	120
Аскорбінова кислота	10	0,038	0,042	0,044	0,044
100	0,340	0,352	0,360	0,363
Танін	10	0,029	0,037	0,042	0,043
100	0,280	0,295	0,303	0,308
Рутін	10	0,013	0,016	0,019	0,019
100	0,150	0,166	0,172	0,175
Кверцетін	10	0,031	0,044	0,051	0,053
100	0,420	0,431	0,438	0,442

Для доказу підсумовуючого характеру визначається величини АОА було вивчено вплив реагенту Fe (III) - о-фенантролін на модельні розчини, до складу яких входили відновники: танін, рутин, кверцетин та аскорбінова кислота у різних співвідношеннях. У таблиці 4 наведено результати аналізу модельних сумішей.

Таблиця 4 Результати аналізу модельних сумішей (Р=0,95; n=3)
Кількість компонентів у суміші	Сумарна АОА, розраховано, мкгАК	Сумарна АОА, знайдено, мкгАК
введено			у перерахунку на АК
АК	Танін	Рутін	Кверцетін	АК	Танін	Рутін	Кверцетін
-	20	20	20	-	16,77	9,56	32,73	59,06	57,08
-	10	10	10	-	8,35	4,77	16,41	29,53	26,95
-	50	10	10	-	42,02	4,77	16,41	63,20	55,04
-	10	50	10	-	8,35	23,93	16,41	48,69	50,06
-	10	10	50	-	8,35	4,77	81,70	94,82	91,61
-	30	10	10	-	25,19	4,77	16,41	46,37	39,24
-	10	30	30	-	8,35	14,35	49,06	71,76	73,47
20	20	20	20	20	16,77	9,56	32,73	79,06	96,29
50	10	10	10	50	8,35	4,77	16,41	87,95	93,07
10	50	10	10	10	42,02	4,77	16,41	73,20	78,15
10	10	50	10	10	8,35	23,93	16,41	58,69	78,74
10	10	10	50	10	8,35	4,77	81,70	104,82	121,45
30	30	10	10	30	25,19	4,77	16,41	76,37	84,59
10	10	30	30	10	8,35	14,35	49,06	81,76	103,31

Розрахунок теоретичної величини сумарної АОА проводили за рівняннями кількісної відповідності, що характеризує антиоксидантну здатність досліджуваного відновника стосовно аскорбінової кислоти, за умов рівної антиоксидантної активності: .

Величину експериментальної (знайденої) АОА розраховували за усередненим рівнянням регресії залежно від АС від кількості аскорбінової кислоти. З результатів, наведених у таблиці 4, видно, що експериментально отримані величини АОА задовільно узгоджуються з теоретично розрахованими.

Таким чином, величина АОА, що визначається, є сумарним показником, а визначення її величини з використанням рівнянь кількісної відповідності є правильним.

Пропонований спосіб апробовано на реальних зразках. Для визначення сумарної АОА реального зразка або його екстракту отримували градуювальні залежності АС від кількості аналіту та аскорбінової кислоти при інкубуванні часу реакційної суміші не менше 90 хвилин. Розрахунок сумарної АОА проводили за формулою (I) і виражали мг аскорбінової кислоти на грам досліджуваного об'єкта (мгАК/г).

Для підтвердження правильності запропонованого способу ці зразки випробовували за відомими методиками, оцінюючи вміст аскорбінової кислоти (ГОСТ 24556-89 Продукти переробки плодів та овочів. Методи визначення вітаміну С) та переважних відновників: у чаї - таніну (ГОСТ 19885-74 Чай. таніну та кофеїну), у плодах шипшини - суму органічних кислот (ГОСТ 1994-93 Плоди шипшини. Технічні умови) (таблиця 5).

1 Большакова Л.С. 1Мілентьєв В.М. 2Санніков Д.П. 3Казьмін В.М. 2

1 ФДБОУ ВПО «Орлівський державний інститут економіки та торгівлі»

2 ФДБУ «Центр хімізації та сільськогосподарської радіології «Орловський»

3 ФДБОУ ВПО «Державний університет – навчально-науково-виробничий комплекс»

Досліджено можливість використання хемілюмінесценції для оцінки антиоксидантної активності харчових речовин. Пропонований спосіб заснований на хемілюмінесценції люмінолу в лужному середовищі, інтенсивність якого залежить від кількості пероксидів у хемілюмінесцентній пробі. Хемілюмінесценцію реєстрували за допомогою розробленої установки, що містить насос-дозатор, світлонепроникну камеру, скляний вакуумний фотоумножитель, комп'ютерну систему. Для посилення хемілюмінесценції до люмінолу додавали розчин залізосинєродистого калію. Зміни інтенсивності хемілюмінесценції фіксували в момент введення проби, що аналізується, в розчин люмінолу. Як аналізовану пробу використовували екстракт кульбаби, отриманий шляхом сухої низькотемпературної перегонки. До його складу входять фенольні сполуки, відомі своєю високою антиоксидантною активністю. Встановлено, що метод хемілюмінесценції може бути використаний визначення антиоксидантних властивостей різних харчових сполук.

Досліджено можливість використання хемілюмінесценції для оцінки антиоксидантної активності харчових речовин. Пропонований спосіб заснований на хемілюмінесценції люмінолу в лужному середовищі, інтенсивність якого залежить від кількості пероксидів у хемілюмінесцентній пробі. Хемілюмінесценцію реєстрували за допомогою розробленої установки, що містить насос-дозатор, світлонепроникну камеру, скляний вакуумний фотоумножитель, комп'ютерну систему. Для посилення хемілюмінесценції до люмінолу додавали розчин залізосинєродистого калію. Зміни інтенсивності хемілюмінесценції фіксували в момент введення проби, що аналізується, в розчин люмінолу. Як аналізовану пробу використовували екстракт кульбаби, отриманий шляхом сухої низькотемпературної перегонки. До його складу входять фенольні сполуки, відомі своєю високою антиоксидантною активністю. Встановлено, що метод хемілюмінесценції може бути використаний визначення антиоксидантних властивостей різних харчових сполук.

Бібліографічне посилання

Паничкін А.В., Большакова Л.С., Мілентьєв В.М., Санніков Д.П., Казьмін В.М. ВИКОРИСТАННЯ ХЕМІЛЮМІНЕСЦЕНЦІЇ ДЛЯ ОЦІНКИ АНТИОКСИДАНТНИХ ВЛАСТИВИЙ ХАРЧОВИХ РЕЧОВИН // Раціональне харчування, харчові добавки та біостимулятори. - 2014. - № 6. - С. 36-37;
URL: http://journal-nutrition.ru/ru/article/view?id=283 (дата звернення: 17.12.2019). Пропонуємо до вашої уваги журнали, що видаються у видавництві «Академія Природознавства»

Ключові слова

вільний радикал/антиоксидант/ антиоксидантна активність / загальна антиоксидантна ємність / хемілюмінесценція/ люмінол / free radical / antioxidant / antioxidant activity / total antioxidant capacity / chemiluminescence / luminol

Анотація наукової статті з хімічних наук, автор наукової роботи - Георгій Костянтинович Володимиров, Є. В. Сергунова, Д. Ю. Ізмайлов, Ю. А. Володимиров

Лікарська рослинна сировина є одним із джерел антиоксидантів для організму людини. Серед методів визначення вмісту антиоксидантів у рослинних об'єктах поширений метод хемілюмінесцентного аналізу. У цій роботі він був використаний для оцінки загальної антиоксидантної ємності(ОАЕ) відварів плодів горобини, шипшини та глоду і настою плодів малини. У досвіді реєстрували кінетику хемілюмінесценціїв системі, що складається з пероксидази хрону, перекису водню та люмінолу. Концентрації та обсяг компонентів системи у пробі були підібрані так, щоб сильні антиоксиданти (аскорбінова кислота) та антиоксиданти середньої сили (кверцетин) повністю окислювалися за час вимірювання (10 хв). Запропоновано та обґрунтовано спосіб розрахунку ОАЕ на основі зміни світлосуми хемілюмінесценціїу присутності рослинних зразків. Аналіз кінетики хемілюмінесценціїпоказав, що у вивчених об'єктах переважають антиоксиданти середньої сили, зокрема флавоноїди, і слабкі антиоксиданти (токоферол та інших.). Зіставлення розрахованих значень ОАЕ для об'єктів, що вивчаються, і даних їх хімічного аналізу показало, що продукти, що містять одну і ту ж кількість антиоксидантів з різним їх співвідношенням за типами, можуть відрізнятися по здатності захищати організм від шкідливого впливу вільних радикалів. Описана методика перспективна вивчення рослинних об'єктів, містять суміш антиоксидантів різних типів.

Схожі теми наукових праць з хімічних наук, автор наукової роботи – Георгій Костянтинович Володимиров, Є. В. Сергунова, Д. Ю. Ізмайлов, Ю. А. Володимиров

• 2016 / Джорджій Владимиров, Сергунова Е.В., Ізмайлов Д.Ю., Владимиров Ю.А.

• Визначення антиоксидантів методом активованої хемілюмінесценції з використанням 2,2"-азо-біс(2-амідинопропану)

  2012 / Алексєєв А.В., Проскурніна О.В., Володимиров Ю.А.

• Антиоксидантна дія дигідрокверцетину та рутину в пероксидазних реакціях, що каталізуються цитохромом з

  2008 / Дьомін Є.М., Проскурніна Є.В., Володимиров Ю.А.

• Оцінка окисної та антиоксидантної здатності біологічних субстратів з хемілюмінесценції, індукованої реакцією Фентона

  2016 / Піскарьов Ігор Михайлович, І.П. Іванова

• Визначення вмісту ліпогідропероксидів у ліпопротеїнах сироватки крові з використанням системи мікропероксидазу-люмінол.

  2011 / Теселкін Юрій Олегович, Бабенкова Ірина Володимирівна

• Методи дослідження антиоксидантів

  2004 / Хасанов Ст Ст, Рижова Г. Л., Мальцева Є. Ст.

• Антиоксидантна активність рослин, що використовуються в етномедицине Туви

  2012 / Чехані Н.Р., Теселкін Ю.О., Павлова Л.А., Козін С.В., Любицький О.Б.

• Вивчення антиоксидантних властивостей Фоспренілу у різних біологічних тест-системах

  2017 / О. В. Санін, О. М. Наровлянський, О. В. Пронін, Т. Н. Кожевнікова, В. Ю. Саніна, О. Д. Агафонова

• Вплив різних доз поліхлорованих біфенілів на стан спонтанної та індукованої імуноглобуліном люмінолзалежної хемілюмінесценції цільної крові

  2016 / Габдулхакова І.Р., Каюмова О.Ф., Самоходова О.В.

• Оцінка системи ліпопероксидації антиоксидантного захисту у дітей з есенціальною артеріальною гіпертензією методами спектро-фотометрії та хемілюмінесценції

  2014 / Натяганова Лариса Вікторівна, Гаврилова Оксана Олександрівна, Колесникова Лариса Романівна

Хімічна чутливість визначення повної антиоксидантної здатності в медичному матеріалі

p align="justify"> Medicinal plant material is one of sources antioxidants for human body. Chemiluminescence analysis є одним з загальних методів визначення вмісту антиоксидантів в матеріалах матеріалу. У нашій роботі, хімічнаluminescence analysis була використана для визначення повної антиоксидантної сили (TAC) з резиденції муки, rose і hawthorn, як добре, як raspberry fruit infusion. Експерименти встановлені кінетиками хімічноїluminescence від системи, що містять консерадичну периксидазу, хлоридний oxide і luminol. Концентрації і розміри компонентів системи були схожі на те, що сильні антиоксиданти (ascorbic acid) і antioxidants average force (quercetin) були повністю oxidized під час вимірювання (10 хвилин). Метод методу TAC калькуляції ґрунтується на змінах в хімічних лампах світлового sum v presence of plant samples був підтверджений і підпорядкований. Analysis of chemiluminescence kinetics доведено, що антиоксиданти послідовності сили домінують в об'єктах, що містяться, включаючи flavonoids і weak antioxidants (tocopherol and others). Порівняння оцінених TAC-відповідей для об'єктів під час випробування і їх хімічної аналітики дані показують, що продукція складається з самої суми антиоксидантів з різними ratios antioxidants відповідно до типів м'якої варіації в їхній здатності до захисту тіла проти radical effects. Технологія описана є промішування одного для вивчення структури об'єктів, що містить змішувачі різних типів антиоксидантів.

Текст наукової роботи на тему «Хемілюмінесцентна методика визначення загальної антиоксидантної ємності у лікарській рослинній сировині»

хемілюмінесцентна методика визначення загальної антиоксидантної ємності в лікарській рослинній сировині

Г. К. Володимиров1 ^, Є. В. Сергунова2, Д. Ю. Ізмайлов1, Ю. А. Володимиров1

1 Кафедра медичної біофізики, факультет фундаментальної медицини, Московський державний університет імені М. В. Ломоносова, Москва

2 Кафедра фармакогнозії, фармацевтичний факультет,

Перший Московський державний медичний університет імені І. М. Сєченова, Москва

Лікарська рослинна сировина є одним із джерел антиоксидантів для організму людини. Серед методів визначення вмісту антиоксидантів у рослинних об'єктах поширений метод хемілю-мінесцентного аналізу. У цій роботі він був використаний для оцінки загальної антиоксидантної ємності (ОАЕ) відварів плодів горобини, шипшини та глоду та настою плодів малини. У досвіді реєстрували кінетику хемілюмінесценції в системі, що складається з пероксидази хрону, перекису водню та люмінолу. Концентрації та обсяг компонентів системи у пробі були підібрані так, щоб сильні антиоксиданти (аскорбінова кислота) та антиоксиданти середньої сили (кверцетин) повністю окислювалися за час вимірювання (10 хв). Запропоновано та обґрунтовано спосіб розрахунку ОАЕ на основі зміни світлосуми хемілюмінесценції у присутності рослинних зразків. Аналіз кінетики хемілюмінесценції показав, що у вивчених об'єктах переважають антиоксиданти середньої сили, у тому числі флавоноїди, та слабкі антиоксиданти (токоферол та ін.). Зіставлення розрахованих значень ОАЕ для об'єктів, що вивчаються, і даних їх хімічного аналізу показало, що продукти, що містять одну і ту ж кількість антиоксидантів з різним їх співвідношенням за типами, можуть відрізнятися по здатності захищати організм від шкідливого впливу вільних радикалів. Описана методика перспективна вивчення рослинних об'єктів, містять суміш антиоксидантів різних типів.

Ключові слова: вільний радикал, антиоксидант, антиоксидантна активність, загальна антиоксидантна ємність, хемілюмінесценція, люмінол

Фінансування: роботу виконано за підтримки Російського наукового фонду, грант № 14-15-00375.

ЕхЗ Для кореспонденції: Георгій Костянтинович Володимиров

119192, м Москва, Ломоносівський пр-т, д. 31, к. 5; [email protected]

Статтю отримано: 10.03.2016 Статтю прийнято до друку: 18.03.2016

хімічна визначальна величина загальної антиоксидантної здатності в медичному матеріалі

1 Department of Medical Biophysics, Faculty of Fundamental Medicine, Ломоносов, Moscow State University, Moscow, Russia

2 Department of Pharmacognosy, Faculty of Pharmacy,

The First Sechenov Moscow State Medical University, Москва, Росія

p align="justify"> Medicinal plant material is one of sources antioxidants for human body. Chemiluminescence analysis є одним з загальних методів визначення вмісту антиоксидантів в матеріалах матеріалу. У нашій роботі, хімічнаluminescence analysis була використана для визначення повної антиоксидантної сили (TAC) з резиденції муки, rose і hawthorn, як добре, як raspberry fruit infusion. Експерименти встановлюються кінетиками хімічноїluminescence системи, що полягають в консервативному кисневому peroxidase, hydrogen peroxide and luminol. Концентрації і розміри компонентів системи були схожі на те, що сильні антиоксиданти (ascorbic acid) і antioxidants average force (quercetin) були повністю oxidized під час вимірювання (10 хвилин). Метод методу TAC калькуляції ґрунтується на змінах в хімічних лампах світлового sum v presence of plant samples був підтверджений і підпорядкований. Analysis of chemiluminescence kinetics доведено, що антиоксиданти послідовності сили домінують в об'єктах, що містяться, включаючи flavonoids і weak antioxidants (tocopherol and others). Порівняння оцінених TAC-відповідей для об'єктів під час випробування і їх хімічної аналітики дані показують, що продукція складається з самої суми антиоксидантів з різними ratios antioxidants відповідно до типів м'якої варіації в їхній здатності до захисту тіла проти radical effects. Технологія описана є промішування одного для вивчення структури об'єктів, що містить змішувачі різних типів антиоксидантів.

Ключові слова: free radical, antioxidant, antioxidant activity, total antioxidant capacity, chemiluminescence, luminol

Funding: ця робота була підтримана Russian Science Foundation, grant no. 14-15-00375.

Посилання: акторів, які мають Andrey Alekseev від Ломоносова Москву State University для своєї допомоги в школі. Correspondence повинна бути addressed: Georgiy Vladimirov

Ломоновський проспект, d. 31, k. 5, Moscow, Russia, 119192; [email protected] Received: 10.03.2016 Accepted: 18.03.2016

Вільні радикали, що утворюються в організмі, порушують структуру мембран клітин, що, своєю чергою, веде до розвитку різних патологічних станів. Руйнівне окисне вплив радикалів попереджає система антиоксидантного захисту організму, в якій важливу роль відіграють низькомолекулярні сполуки – перехоплювачі (пастки) радикалів. Одним із джерел антиоксидантів є лікарська рослинна сировина, а також препарати на її основі, вивчення антиоксидантного потенціалу яких допомагає підвищити їх профілактико-терапевтичний ефект.

Основні методики визначення антиоксидантів розглянуті в роботах, проте визначення антиокси-дантів як хімічних сполук не дає повного уявлення про захисні властивості об'єкта, що вивчається: вони обумовлюються не тільки кількістю того чи іншого антиоксиданту, але також активністю кожного з них. Активність антиоксиданту, або антиоксидантна активність, АОА - це константа швидкості реакції антиоксиданту з вільним радикалом (kInH). Метод хемілюмінесценції (ХЛ) дозволяє визначати загальну кількість радикалів, яке пов'язують антиоксиданти у зразку (загальну антиоксидантну ємність, ОАЕ), а при використанні методу математичного моделювання кінетики ХЛ - також швидкість утворення і реакції радикалів з антиокси-дантами, тобто АОА.

Найбільш поширена модифікація хемілюмінесцентного методу визначення загальної антиоксидантної ємності заснована на застосуванні люмінолу в якості активатора хемілюмінесценції. У кювету хемілю-мінометра поміщають зразок з додаванням люмінолу, пероксиду водню та сполуки, здатної утворювати радикали в результаті спонтанного розпаду (термолізу), наприклад 2,2"-азобіс-(2-амідинопропан) дигідрохлориду (АБАП):

У присутності молекулярного кисню алкільний радикал R ^ утворює пероксильний радикал ROO ^:

ROO^ + LH2 ^ ROOH + LHv З LH через утворення проміжних речовин (гід-ропероксиду люмінолу та ендопероксиду люмінолу) утворюється молекула кінцевого продукту окислення люміно-лу, амінофталевої кислоти, в електронно-збудженому стані, яка висвічує фотон, . Інтенсивність ХЛ пропорційна швидкості утворення фотонів, а вона, у свою чергу, пропорційна стаціонарній концентрації LH у системі. Взаємодіючи з радикалами, антиоксиданти переривають описаний ланцюжок перетворень і перешкоджають утворенню фотона.

Сполуки, схильні до термолізу, - не єдине можливе джерело радикалів при аналізі антиоксидантної ємності зразка хемілюмінесцентним методом. Альтернативами є системи пероксидазу хрону-перекис водню, гемін-пероксид водню, цитохром с-кардіоліпін-пероксид водню та ін. Схема реакцій окиснення люмінолу пероксидазами розглянута в роботі Cormier та співавт. .

Кінетичні криві ХЛ для цих систем відображають дві стадії реакції: стадію збільшення інтенсивності ХЛ та стадію плато або поступового спаду свічення, коли

інтенсивність ХЛ або постійна, або повільно знижується. У роботі описано два підходи до вимірювання загальної антиоксидантної ємності, що враховують цю особливість кривих. Метод TRAP (Total Reactive Antioxidant Potential) заснований на вимірюванні латентного періоду ХЛ т і може бути використаний для визначення таких антиоксидантів, як тролокс або аскорбінова кислота: вони характеризуються високим значенням константи швидкості реакції з радикалами і тому можуть бути названі сильними антиоксидантами . Протягом латентного періоду відбувається повне окислення. Методом TAR (Total Antioxidant Reactivity) вимірюють ступінь гасіння хемілюмінесценції q на плато або в максимумі хемілю-мінесцентної кривої:

де I - інтенсивність хемілюмінесценції без антиоксиданту, а 11 - інтенсивність ХЛ у присутності антиоксиданту. Цей метод використовується, якщо в системі присутні переважно слабкі антиоксиданти з низькими константами швидкості взаємодії з радикалами - набагато нижчими порівняно з константою люмінолу.

Дія антиоксидантів характеризують як показниками т і ц. Як видно з робіт дія таких антиоксидантів, як сечова кислота в системі гемін-Н202-люмінол або токоферол, рутин і кверцетин в системі цитохром с-кардіоліпін-Н202-люмінол, характеризується зміною максимальної швидкості наростання ХЛ (утх). Як показують результати математичного моделювання кінетики, значення констант швидкості взаємодії цих антиоксидантів з радикалами близькі до значення константи люмінолу, тому антиоксиданти можуть бути названі антиоксидантами середньої сили .

Якби матеріал, що вивчається, зокрема рослинна сировина, містив тільки один тип антиоксидантів, то їх вміст можна було б характеризувати одним з трьох перерахованих вище показників (т, ц або V). Але в рослинній сировині міститься суміш антиоксидантів різної сили. Щоб вирішити цю проблему, деякі автори використали зміну світлосуми хемілюмінесценції за певний час ДЕ, розраховану за формулою

ДЕ = ДЕ0 - ДЕ,

де ДЕ0 та ДЕ5 - світлосуми ХЛ за заданий час? у контрольному та досліджуваному зразках відповідно. Час має бути достатнім для окислення всіх антиоксидантів у системі, тобто для виходу кривої ХЛ досліджуваного зразка на рівень кривої ХЛ контрольного зразка. Останнє передбачає, що дослідники повинні не тільки реєструвати світлосуму світіння, а й записувати криву кінетики ХЛ протягом досить тривалого часу, що роблять далеко не завжди.

Оскільки всі показники, що вимірюються, залежать від приладу та умов вимірювання, антиоксидантний ефект речовини в досліджуваній системі зазвичай порівнюють з ефектом антиоксиданту, прийнятого за стандарт, наприклад тролоксу .

Система пероксидаза хрону-пероксид водню застосовувалася для аналізу загальної антиоксидантної ємності рослинної сировини багатьма авторами. У роботах з оцінки кількості антиоксидантів у зразках використовували латентний період ХЛ (метод TRAP), а роботах - площа під кривою розвитку ХЛ. Однак у перерахованих роботах не дано чіткого обґрунтова-

вання вибору того чи іншого параметра для оцінки ОАЕ.

Метою дослідження було визначити, як співвідношення антиоксидантів різного типу впливає на ОАЕ, і модифікувати метод хемілюмінесценції таким чином, щоб точніше визначати ОАЕ в рослинній сировині. Для цього ми поставили собі кілька завдань. По-перше, порівняти кінетику ХЛ досліджуваних об'єктів з кінетикою стандартних антиоксидантів трьох типів (сильного, середнього та слабкого), щоб зрозуміти, антиоксиданти якого типу роблять основний внесок в ОАЕ досліджуваних об'єктів. По-друге, розрахувати ОАЕ досліджуваних об'єктів, вимірявши зменшення світлосуми ХЛ під дією цих об'єктів у порівнянні з дією антиоксиданту, що забезпечує найбільший внесок в ОАЕ.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

Об'єктами дослідження були промислові зразки плодів глоду, горобини та шипшини виробництва АТ «Красногорсклексредства» (Росія), а також плоди малини, зібрані авторами на території Московської області в умовах природного зростання і висушені при температурі 60-80 ° С до припинення виділення ними соку деформації при натисканні.

Реактивами для аналізу антиоксидантної ємності хемілюмінесцентним методом були: KH2PO4, 20 мМ буферний розчин (рН 7,4); пероксидаза з коріння хрону (активність 112 од./мг, М = 44 173,9), 1 мМ водний розчин; люмінол (5-аміно-1,2,3,4-тетрагідро-1,4-фталазиндіон, гідразид 3-амінофталевої кислоти, М = 177,11), 1 мМ водний розчин; пероксид водню (Н2О2, М = 34,01), 1 мМ водний розчин; розчини антиоксидантів (аскорбінової кислоти, кверцетину, токоферолу) Всі реагенти – виробництва фірми Sigma Aldrich (США).

Відвари плодів глоду, горобини та шипшини та настій плодів малини готували за методикою Державної фармакопеї СРСР, викладеної у загальній фармакопейній статті «Настої та відвари».

Визначення загальної антиоксидантної ємності проводили шляхом реєстрації хемілюмінесценції на хемі-люмінометрі Lum-100 (ДІСофт, Росія) з використанням програмного забезпечення PowerGraph 3.3. Для визначення ОАЕ в рослинній сировині в кювету приладу поміщали 40 мкл люмінолу в концентрації 1 мМ, 40 мкл пероксидази хрону в концентрації 0,1 мкМ, від 10 до 50 мкл відвару або настою (залежно від концентрації) та фосфатний буфер у кількості доведення загального обсягу проби до 1 мл. Кювету встановлювали у прилад та реєстрували ХЛ, спостерігаючи фоновий сигнал. Після закінчення 48 з реєстрації фонового сигналу в кювету вносили 100 мкл Н2О2 концентрації 1 мМ і продовжували реєстрацію ХЛ протягом 10 хв. Готували по чотири проби з різною концентрацією кожного з рослинних об'єктів. Реєстрували також ХЛ для розчинів аскорбінової кислоти, кверцетину та токоферолу в п'яти різних концентраціях для кожного з антиоксидантів. Надалі ОАЕ зразків відварів та настою перераховували на кверцетин.

Концентрації люмінолу, пероксидази хрону та перекису водню були підібрані так, щоб визначати антиоксидантну ємність водних витягів з лікарської рослинної сировини за прийнятний час (не більше 10 хв). За цей час криві хемілюмінесценції для антиоксидантів аскорбату та флавоноїду кверцетину (основні антиоксиданти рослинної сировини)

виходили на плато, що вказувало на повну руйнацію антиоксидантів у системі. Розведення досліджуваних зразків та концентрації розчинів стандартних антиокси-дантів (вказані у підписах до малюнків) підбирали таким чином, щоб усі кінетичні криві ХЛ були виміряні за однієї і тієї ж чутливості приладу.

Антиоксидантну ємність розраховували щодо зміни площі (AS) під кінетичною кривою хемілюмінесценції (світлосуми) при додаванні речовини, що містить антиоксидант. Для цього підраховували S0 для системи без антиоксиданту і віднімали з неї площу SS, що характеризує систему, до якої був доданий антиоксидант. Величина AS залежить від чутливості хемілюмінометра і умов вимірювання. Відношення AS/C ■ V (де C - концентрація досліджуваного біологічного матеріалу в кюветі, г/л, і V - об'єм кювети, л) виражає антиоксидантну ємність 1 г матеріалу, що вивчається, тобто рослинної сировини.

Аналогічним чином розраховували антиоксидантну ємність ASa розчину стандартного антиоксиданту, наприклад кверцетину, поміщеного в той же обсяг реакційної суміші. Відношення AS/CÄ V (де CA - вагова концентрація антиоксиданту в кюветі, г/л) виражає антиоксидантну ємність 1 г антиоксиданту.

Для кожного зі стандартних антиоксидантів реєстрували сигнал від розчинів декількох концентрацій, щоб переконатися, що розрахунки ведуться в межах лінійної залежності, а отримані результати відтворюються. Справді, була отримана лінійна залежність (ASa = kA CA) сигналу від концентрації, за якою розрахували стехіометричний коефіцієнт kA. За критерієм Фішера, отримані для стандартних антиоксидантів значення kA статистично значущі з ймовірністю 0,975. Далі реєстрували сигнал від чотирьох концентрацій для кожного з чотирьох зразків рослин, і для всіх зразків отримали лінійну залежність сигналу від концентрації (AS = k ■ C), за якою розрахували стехіометричний коефіцієнт k. З ймовірністю 0,975 (критерій Фішера) отримані для рослинних зразків значення статистично значущі. Загальну антиоксидантну ємність рослинного матеріалу в перерахунку на масу стандартного антиоксиданту (мг%) знаходили за формулою

ОАЕ = k ■ 105. k

Значення були представлені як середнє арифметичне ± середньоквадратичне відхилення (M ± 5) при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Вивчення кінетики хемілюмінесценції у присутності аскорбату натрію (рис. 1) показало, що для цього антиоксиданту характерний латентний період, коли ХЛ практично повністю пригнічена. Його тривалість пропорційна кількості антиоксиданту у системі. При цьому не змінюється нахил кривих ХЛ, ні інтенсивність ХЛ на плато. Це пояснюється тим, що аскорбінова кислота - сильний антиоксидант, що перехоплює всі радикали, що утворюються в системі, у тому числі радикали люмінолу, і ХЛ не розвивається доти, доки не окислиться весь аскорбат.

Дія токоферолу (рис. 2) виявлялося зниженням інтенсивності ХЛ на плато, що характерно для слабких антиоксидантів, хоча токоферол вважається одним з самих

сильних антиоксидантів. Можливо, така невідповідність пов'язана з тим, що у нашому досвіді вільні радикали перебували у водному розчині, тоді як зазвичай дію токоферолу вивчають у неполярних середовищах. В роботі, де джерелом радикалів служив комплекс цитохрому з кардіоліпіном і реакція з люмінолом протікала в межах цього комплексу, токоферол мав властивості антиоксиданту середньої сили.

Вивчивши дію різних концентрацій кверцетину на нашу систему (рис. 3) і порівнявши кінетичні криві для нього та аскорбату натрію та токоферолу, можна відзначити, що основна дія кверцетину проявляється у зміні кута нахилу кривих, тобто швидкості розвитку ХЛ, що типово для антиоксидантів середньої сили

Криві ХЛ для всіх відварів (рис. 4) нагадують криві для кверцетину з незначним зниженням інтенсивності ХЛ в кінці, тобто при виході на

Час, хв

Мал. 1. Вплив аскорбату натрію на кінетику хемілюмінесценції

Концентрації компонентів системи: люмінол – 40 мкМ, пероксидаза хрону – 4 нМ, пероксид водню – 100 мкМ. Криві: 1 – контрольний зразок; 2 – 0,05 мкМ; 3 – 0,10 мкМ; 4 – 0,15 мкМ; 5 – 0,2 мкМ; 6 – 0,25 мкМ аскорбату натрію.

плато. Як показано в роботі, така поведінка характерна для антиоксидантів середньої сили, до яких у нашому випадку можна віднести поліфеноли - флавоно-іди та дубильні речовини. Для настою з плодів малини (рис. 4, Г) помітно зниження хемілюмінесценції на рівні плато, що характерно для слабких антиоксидантів, яким у даному випадку є токоферол. У перерахунку на кверцетин та токоферол у настої плодів малини міститься 4,7±0,9 мкмоль/г кверцетину та 11,9±0,8 мкмоль/г токоферолу.

При порівнянні кривих хемілюмінесценції, отриманих для різних концентрацій чотирьох досліджуваних водних витягів з рослинної сировини, показано, що внесок середніх і слабких антиоксидантів у загальну антиоксидантну ємність зразків знижувався в ряду: настій плодів малини (рис. 4, Г), відвар плід 4, В), відвар плодів горобини (рис. 4, А), відвар плодів глоду (рис. 4, Б). Значення AS у розрахунку концентрацію З досліджуваного речовини в кюветі і значення загальної антиоксидантної ємності у перерахунку на кверцетин наведені у таблиці.

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Отримані в ході експериментів дані та розраховані на їх основі величини ОАЕ об'єктів, що вивчаються, були зіставлені з вмістом в них основних антиокси-дантів, визначених за допомогою хімічних методів аналізу . Незважаючи на те, що позитивна кореляція між сумарною кількістю антиоксидантів і ОАЕ в різних об'єктах безсумнівна, все ж між цими показниками є помітні відмінності. Наприклад, якщо взяти суму вмісту флавоноїдів, дубильних речовин і аскорбінової кислоти, то вона виявляється більшою за розраховану ОАЕ для всіх об'єктів, що вивчаються, крім відвару плодів глоду (таблиця).

Іншими дослідниками також показано, що результати хімічного аналізу та значення ОАЕ, визначене хемілюмінесцентним методом, часто не збігаються. У роботі загальна антиоксидантна ємність, визначена

46 Час, хв

I" " ч чи----.

Мал. 2. Вплив токоферолу на кінетику хемілюмінесценції

Концентрації компонентів системи: люмінол – 40 мкМ, пероксидаза хрону – 4 нМ, пероксид водню – 100 мкМ. Криві: 1 – контрольний зразок; 2 – 0,01 мкМ; 3 – 0,025 мкМ; 4 – 0,06 мкМ; 5 – 0,1 мкМ; 6 – 0,2 мкМ токоферолу.

46 Час, хв

Мал. 3. Вплив кверцетину на кінетику хемілюмінесценції Концентрації компонентів системи: люмінол – 40 мкМ, пероксидаза хрону – 4 нМ, пероксид водню – 100 мкМ. Криві: 1 – контрольний зразок; 2 – 0,02 мкМ; 3 – 0,03 мкМ; 4 – 0,04 мкМ; 5 – 0,05 мкМ; 6 – 0,06 мкМ кверцетину.

Час, хв

46 Час, хв

46 Час, хв

120 I 100 80 \ 60 40 20

46 Час, хв

Мал. 4. Вплив відварів плодів горобини (А), глоду (Б), шипшини (В) та настою з плодів малини (Г) на кінетику хемілюмінесценції Концентрації компонентів системи: люмінол - 40 мкМ, пероксидаза хрону - 0 нМ, пероксидаза хрону - 0 нМ, . (А) Криві: 1 – контрольний зразок; 2 – 0,002 г/л; 3 – 0,004 г/л; 4 – 0,006 г/л; 5 - 0,008 г/л відвару плодів горобини. (Б) Криві: 1 – контрольний зразок; 2 – 0,005 г/л; 3 – 0,0075 г/л; 4 – 0,01 г/л; 5 - 0,0125 г/л відвару плодів глоду. (В) Криві: 1 – контрольний зразок; 2 – 0,001 г/л; 3 – 0,0015 г/л; 4 – 0,002 г/л; 5 - 0,0025 г/л відвару плодів шипшини. (Г) Криві: 1 – контрольний зразок; 2 – 0,001 г/л; 3 – 0,003 г/л; 4 – 0,004 г/л; 5 – 0,005 г/л настою плодів малини.

у системі пероксидаза-люмінол-перекис водню корелювала із вмістом тритерпенових сполук. Однак у роботі тих самих авторів, у якій об'єктом дослідження була інша рослина, не спостерігали кореляції ОАЕ із вмістом будь-якої групи речовин, у тому числі флавоноїдів.

Подібні розбіжності пов'язані щонайменше із трьома чинниками. По-перше, має значення активність антиоксидантів, тобто швидкість їх взаємодії з радикалами, яка різна для різних антиоксидантів, що входять до складу рослинного зразка. За даними Ізмайлова, константи швидкості відповідних реакцій для мексидолу, токоферолу та кверцетину співвідносяться як 0,04:2:60. По-друге, кожна молекула антиоксиданту, вступаючи в хімічну реакцію, може перехопити різну кількість радикалів. За даними роботи , кверцетин, сечова і аскорбінова кислоти перехоплювали 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 і 0,5 ± 0,2 радикалів на одну молекулу антиоксиданту, що прореагувала відповідно (використовувалася система гемін-Н202-люмінол). . По-третє, на результати дослідження могло вплинути наявність пероксидазної активності у самих рослинних зразків, як у роботі, а також наявність у зразках кальцію, який, як це показано в роботі, здатний у певних умовах підвищувати активність пероксидази хрону. Зазвичай це обумовлює більш ви-

соку інтенсивність ХЛ на плато, ніж контрольних кривих, чого ми, проте, не спостерігали.

Перший фактор різко обмежує застосування такого параметра, як зміна світлосуми, так як час вимірювання хемілюмінесценції має бути більшим за час витрачання всіх антиоксидантів у досліджуваному зразку. Про настання цього моменту можна судити лише вимірюваючи кінетику хемілюмінесценції. Крім того, внесок слабких антиоксидантів в ОАЕ різко занижений, оскільки час їхнього повного окислення значно перевищує прийнятну тривалість вимірювання (10-20 хв).

Ще більше значення має стехіометричний коефіцієнт антиоксиданту. Кількість радикалів п, що їх перехоплює, дорівнює

де р – стехіометричний коефіцієнт, а Am – зміна концентрації антиоксиданту за час вимірювання, у нашому випадку – вихідна концентрація досліджуваної речовини в дослідній пробі.

Різниця в світлосумі свічення без антиоксиданту і в його присутності пропорційна п. Сумарна кількість перехоплених радикалів дорівнює п = Y.p. m,

де - стехіометричний коефіцієнт конкретного антиоксиданту, а m - його концентрація під час змі-

Об'єкт дослідження Флавоноїди, мг%* Дубильні речовини, мг%* Аскорбінова кислота, мг%* AS/C ■ 10-8, ум. од. ОАЕ, мг% кверцетину

Відвар плодів горобини 8,87±0,01 210,00±10,00 0,67±0,02 7,13±0,96 56,53±7,61

Відвар плодів шипшини 4,66±0,04 850,00±20,00 3,70±0,12 16,60±3,40 131,63±27,26

Відвар плодів глоду 3,01 ± 0,06 12,00 ± 3,00 0,23 ± 0,002 3,18 ± 0,29 25,20 ± 2,32

Настій висушених плодів малини 90,00 ± 4,00 40,00 ± 20,00 3,91 ± 0,08 6,65 ± 1,21 52,69 ± 9,56

Примітка: * - Літературні дані, . AS – зміна світлосуми для зразка, отн. од., C - концентрація зразка у кюветі, г/л. Розраховані значення достовірні при p<0,05. Число измерений для каждого образца - четыре.

ренія. Сумарна кількість перехоплених радикалів явно не дорівнює сумарній кількості антиоксидантів, оскільки коефіцієнти pt не тільки не рівні одиниці, але і суттєво відрізняються для різних антиоксидантів.

Величина n пропорційна різниці світлосум, виміряних за певний час між зразком, що містить антиоксидант, і контрольним зразком, що не містить антиоксидантів:

де k - Коефіцієнт, постійний за однакових умов вимірювання.

Розглянутий у статті метод дозволяє визначити загальну антиоксидантну ємність, тоді як хімічний аналіз дозволяє визначити сумарний вміст антиоксидантів у продукті. Тому метод хемілюмінесценції представляється інформативнішим за хімічні аналізи.

Підібрані нами умови оцінки загальної антиоксидантної ємності рослинної сировини методом реєстрації кінетики хемілюмінесценції в системі, що складається з пероксидази хрону, перекису водню та люмінолу (концентрації компонентів - 4 нМ, 100 мкМ і 40 мкМ ф 4, 40 мкМ 4, 40 мкМ 4 , відповідно; ),

забезпечили окислення сильних антиоксидантів (аскорбінова кислота) та антиоксидантів середньої сили (квер-цетин) за 10 хв. Така тривалість вимірювання зручна та забезпечує необхідну якість вимірювань.

Аналіз кінетики хемілюмінесценції показав, що в вивчених об'єктах (відварах плодів горобини, шипшини, глоду і настої плодів малини) основними антиоксидантами є антиоксиданти середньої сили, в тому числі флавоноїди, і слабкої сили (токоферол та ін). На основі зменшення світлосуми хемілюмінесценції було розраховано загальну антиоксидантну ємність для вивчених об'єктів. Порівняння отриманих значень ОАЕ з результатами хімічного аналізу показало, що продукти, що містять однакову кількість антиоксідантів з різним їх співвідношенням, можуть відрізнятися за своєю здатністю ефективно захищати організм від шкідливого впливу вільних радикалів. Описана методика перспективна вивчення рослинних об'єктів, у яких міститься суміш різних антиоксидантів. При цьому вона відрізняється простотою та невисокою вартістю дослідження. Поєднання вимірювання кінетики хемілюмінесценції з математичним моделюванням реакцій дозволить не лише автоматизувати процес визначення ОАЕ, а й визначати внесок окремих груп антиоксидантів у показник.

Література

1. Проскурніна Є. В., Володимиров Ю. А. Вільні радикали як учасники регуляторних та патологічних процесів. У СБ: Григор'єв А. І., Володимиров Ю. А., редактори. Фундаментальні науки – медицині. Біофіз. мед. технол. М: МАКС Прес; 2015. т. 1. с. 38-71.

3. Хасанов В. В., Рижова Г. Л., Мальцева Є. В. Методи дослідження антиоксидантів. Хім. росл. сировини. 2004; (3): 63-75.

4. Васильєв Р. Ф., К'нчева В. Д., Федорова Г. Ф., Б'товська Д. І., Трофімов А. В. Антиоксидантна активність халконів. Хе-мілюмінесцентне визначення реакційної здатності та квантово-хімічний розрахунок енергій та будови реагентів та інтермедіатів. Кінетика та каталіз. 2010; 51 (4): 533-41.

6. Fedorova GF, Trofimov AV, Vasil'ev RF, Veprintsev TL. Peroxy-

radical-mediated chemiluminescence: механічна diversity і fundamentals for antioxidant assay. Arkivoc. 2007; 8: 163-215.

8. Bastos EL, Romoff P, Eckert CR, Baader WJ. Визначення антирадііческой сили по H2O2-hemin-індукованої luminol chemiluminescence. J Agric Food Chem. 2003 р. Dec 3; 51 (25): 7481-8.

9. Володимиров Ю. А., Проскурніна Є. В. Вільні радикали та клітинна хемілюмінесценція. Успіхи біол. хім. 2009; 49: 341-88.

10. Володимиров Ю. А., Проскурніна Є. В., Ізмайлов Д. Ю. Кінетична хемілюмінесценція як метод вивчення реакцій вільних радикалів. Біофізика. 2011; 56 (6): 1081-90.

11. Ізмайлов Д. Ю., Дьомін Є. М., Володимиров Ю. А. Визначення активності антиоксидантів методом вимірювання кінетики хемілюмінесценції. Фотобіологія та фотомедицина. 2011; 7(2): 70-6.

12. Лісі ЕА, Pascual C, Del Castillo MD. Luminol luminescence induced 2,2"-Azo-bis(2-amidinopropane) thermolysis. Free

Radic Res Commun. 1992; 17(5): 299-311.

13. Лісі ЕА, Pascual C, Del Castillo MD. На основі використання керуючого світлового освітленнявимірює діяльність SOD. Free Radic Biol Med. 1994 р. Jun; 16(6): 833-7.

15. Lissi ЕА, Salim-Hanna M, Pascual C, Del Castillo MD. Визначення загальної антиоксидантної потреби (TRAP) і повної антиоксидантної реакції від luminol-enhanced chemiluminescence measurements. Free Radic Biol Med. 1995 р. Feb; 18(2): 153-8.

17. Cormier MJ, Prichard PM. На investigation of mechanism of luminescent peroxidation luminol by stopped flow techniques. J Biol Chem. 1968 Sep 25; 243 (18): 4706-14.

21. Алексєєв А. В., Проскурніна Є. В., Володимиров Ю. А. Визначення антиоксидантів методом активованої хемілюмінесценції з використанням 2,2"-азо-біс(2-амідинопро-пана). Вестн. МГУ. Сер. 2. Хім.2012, 53 (3): 187-93.

24. Міністерство охорони здоров'я СРСР Державна фармакопея СРСР XI вид. Вип. 2 “Загальні методи аналізу. Лікарська рослинна сировина». М: Медицина; 1987. с. 147-8.

25. Сергунова Є. В., Сорокіна А. А., Корнюшина М. А. Вивчення екстракційних препаратів шипшини. Фармація. 2012; (2): 14-6.

26. Сергунова Є. В., Сорокіна А. А., Аврач А. С. Вивчення плодів глоду різних способів консервації та водних витягів. Фармація. 2010; (5): 16-8.

27. Аврач А. З., Сергунова Є. У., Куксова Я. У. Біологічно активні речовини плодів і водних витягів малини звичайної. Фармація. 2014; (1): 8-10.

28. Аврач А. С., Самиліна І. А., Сергунова Є. В. Вивчення біологічно активних речовин плодів глоду - сировини для приготування настоянок гомеопатичних матричних. У сб. наук. тр. за матеріалами XXIV Моск. міжнар. гомеопат. конф. «Розвиток гомеопатичного методу у сучасній медицині»; 24-25 січня 2014 р.; Москва. М.; 2014. с. 146-7.

29. Сергунова Є. В., Сорокіна А. А. Вивчення складу біологічно активних речовин у лікарській рослинній сировині різних способів консервації. У сб. тез за матеріалами ХХ Росс. нац. конгр. «Людина та ліки»; 15-19 квітня 2013 р.; Москва. М.: ЕкООніс; 2013. с. 184-90.

30. Александрова Є. Ю., Орлова М. А., Нейман П. Л. Вивчення пероксидазної активності в екстрактах з кореневища та коренів хрону та її стабільності до різних впливів. Вестн. МДУ. Сер. 2. Хім. 2006; 47 (5): 350-2.

1. Проkurnina EV, Vladimirov YuA. Свободние radikaly як uchastniki regulatornyh і patologicheskikhch protsessov. У: Грігор "Ев AI, Владимиров ЮА, editors. Fundamental"nye nauki - meditsine. Біофізичні медичні технології. Москва: MAKS Press; 2015. v. 1. p. 38-71. Російська.

2. Chanda S, Dave R. In vitro моделі для антиоксидантної активності дії і деякі медичні рослини, що посідають antioxidant properties: An overview. Afr J Microbiol Res. 2009 Dec; 3(13): 981-96.

3. Хасанов В.В., Рижова Г.Л., Мальцева ЕВ. Методи дослідження антиоксидантів.

4. Васил"єв RF, К"нчева ВД, Федорова ГФ, Б"товська ДИ, Трофімов А.В. Кемільюменістентное заподіяння реакціонної здатності і квантово-хіміческій розраховують енергію і строенія реагентів і intermediatov. Kinetics and catalysis. 2010; 51 (4): 533-41. Російська.

5. Славова-Казакова АК, Angelova SE, Veprintsev TL, Denev P, Fabbri D, Dettori MA, et al. Antioxidant потенційний curcumin-related compounds studied chemiluminescence kinetics, chain-breaking efficiencies, scavenging activity (ORAC) і DFT calculations. Beilstein J Org Chem. 2015 Aug 11; 11: 1398-411.

6. Fedorova GF, Trofimov AV, Vasil"ev RF, Veprintsev TL. Peroxy-radical-mediated хімічнаluminescence: механічна diversity і fundamentals for antioxidant assay. Arkivoc. 2007; 8: 163-215.

7. Fedorova GF, Menshov VA, Trofimov AV, Vasil"ev RF. Facile chemiluminescence assay for antioxidative properties of vegetable lipids: fundamentals and illustrative examples. Analyst. 2009 Oct; 134 (10): 2128-34.

8. Bastos EL, Romoff P, Eckert CR, Baader WJ. Evaluation of antiradical capacity H2O2-hemin-induced luminol

9. Владимиров ЮА, Прокурніна ЕВ. Свободние radikaly і клеточна khemilyuminestentstia. Usp Biol Khim. 2009; 49: 341-88. Російська.

10. Владимиров ЮА, Проскуриніна ЕВ, Ізмалев ДЮ. Кінетіческая кеміліумінсценція як метод вивчення реакції slobodних radikalov. Biophysics. 2011; 56 (6): 1081-90. Російська.

11. Izmailov DYu, Demin EM, Vladimirov YuA. Оподілення активності антиоксідантов методом ісмеренія кінетики кемілюмінестсен-ціі. Fotobiologiya i fotomeditsina. 2011; 7(2): 70-6. Російська.

12. Лісі ЕА, Pascual C, Del Castillo MD. Luminol luminescence induced by 2,2"-Azo-bis(2-amidinopropane) thermolysis. Free Radic Res Commun. 1992; 17 (5): 299-311.

13. Лісі ЕА, Pascual C, Del Castillo MD. На основі використання керуючого світлового освітленнявимірює діяльність SOD. Free Radic Biol Med. 1994 р. Jun; 16(6): 833-7.

14. Lissi EA, Escobar J, Pascual C, Del Castillo MD, Schmitt TH, Di Mascio P. Висока хімічна освіта поєднана з реакцією між methemoglobin або oxyhemoglobin with hydrogen peroxide. Photochem Photobiol. 1994 Nov; 60(5): 405-11.

15. Ліссі EA, Salim-Hanna M, Pascual C, Del Castillo MD. Визначення загальної антиоксидантної потреби (TRAP) і повної антиоксидантної реакції від luminol-enhanced chemiluminescence measurements. Free Radic Biol Med. 1995 р. Feb; 18(2): 153-8.

16. Landi-Librandi AP, Oliveira CA, Azzolini AE, Kabeya LM, Del Ciampo JO, Bentley MV, et al. In vitro оцінка антиоксидантної діяльності liposomal flavonols до HRP-H2O2-luminol system. J Microencapsul. 2011; 28 (4): 258-67.

17. Cormier MJ, Prichard PM. An investigation of the mechanism

of luminescent peroxidation of luminol by stopped flow techniques. J Biol Chem. 1968 Sep 25; 243 (18): 4706-14.

18. Chang CL, Lin CS, Lai GH. Фітохімічні особливості, безкоштовні регулярні шпильки діяльності, і невтікання фізики медичних робіт extracts. Evid Based Complement Alternat Med. 2012; 2012: 984295. doi: 10.1155/2012/984295. Epub 2011 Aug 10.

19. Chang CL, Lin CS. Фітохімічна композиція, антиоксидантна діяльність, і нейропротекційний ефект terminula chebula Retzius extracts. Evid Based Complement Alternat Med. 2012; 2012: 125247. doi: 10.1155/2012/125247. Epub 2011 Jul 5.

20. Georgetti SR, Casagrande R, Di Mambro VM, Azzolini AE, Fonseca MJ. Зміна антиоксидантної діяльності різних flavonoids до хімічноїluminescence метод. AAPS PharmSci. 2003; 5(2): 111-5.

21. Алексєєв А.В., Проkurnina EV, Vladimirov YuA. Запобігання антиоксідантам методом активованої кеміліумінецентності з іспол"зуванням 2,2"-азо-біс(2-амідінопропан). Moscow University Chemistry Bulletin. 2012; 53 (3): 187-93. Російська.

22. Pogacnik L, Ulrih NP. Application of optimized chemiluminescence assay for determination of antioxidant capacity of herbal extracts. Luminescence. 2012 Nov-Dec; 27 (6): 505-10.

23. Saleh L, Plieth C. Об'ємний low-molecular-weight antioxidants, як загальний показник, визначений в біологічних випадках згідно з хімічноюluminescence inhibition assay. Nat Protoc. 2010 Sep; 5(10): 1627-34.

24. Міністерство zdravookhraneniya SSSR. Государсвенная фармакопея SSSR. 11th ed. Iss. 2. "Обшчі методи аналізу.

Лікарственний растітель "ное сір'е". Москва: Medltsina; 1987. p. 147-8.

25. Сергунова EV, Sorokina AA, Kornyushina MA. Ізучення екстракційних preparatov shipovnika. Фармакокінетика. 2012; (2): 14-6. Російська.

26. Sergunova EV, Sorokina AA, Avrach AS. Вивчення плодів боярішника различных способів консервації і водних ізвлеченні. Фарматія. 2010; (5): 16-8. Російська.

27. Avrach AS, Sergunova EV, Kuksova YaV. Біологіческіе активні вещества плодів і водних ізвлеченіі maliny obyknovennoy. Фарматія. 2014; (1): 8-10. Російська.

28. Avrach AS, Samylina IA, Sergunova EV. Ізучення біологічно активних величеств plodov boyaryshnika - syr"ya для приготування насток gomeopaticheskikh matrichnykh. M., 2014. p. 146- 7. Російська.

29. Sergunova EV, Sorokina AA. Ізучення складу біологічно активних вежств в лікарственном растітельном сирі ралічних способів консервації. Proceedings of the 20th Russian National Congress "Chelovek i lekarstvo"; 2013 Apr 1519; Москва. Москва: EkOOnis; 2013. p. 184-90. Російська.

30. Aleksandrova EYu, Orlova MA, Neiman PL. Ізучення пероксідазной активності в екстрактах з корневіша і корнеї хрена і її стабільності до розрахункових вантажівок.

Антиоксиданти (АТ)- Речовини, що перешкоджають окисленню. У живому організмі провідним фактором окислення є утворення вільних радикалів, тому дія антиоксидантів у біологічних системах розглядається переважно з позиції запобігання окисленню органічних речовин вільними радикалами.

В даний час існує велика кількість різних методів визначення антиоксидантів: фотометричні, хімічні, електрохімічні та ін. Однак, багато з них мають суттєві недоліки, що ускладнюють розуміння та подальше використання результатів, отриманих цими методами. До найпоширеніших недоліків можна віднести такі:

• Використовуються штучні чи нехарактерні умови для біологічних систем вимірювання антиоксидантної дії. Наприклад, замість біологічних вільно-радикальних реакцій використовуються чисто хімічні окислювально-відновні реакції або здійснюється вимірювання здатності речовини віддавати/приймати електрони за впливом електричного струму. Результати вимірювань, отримані в таких умовах, не дозволяють говорити про те, що досліджувана речовина виявлятиме таку ж "антиоксидантну" дію в організмі.
• Визначення антиоксидантної дії здійснюється шляхом вимірювання кількості накопичених продуктів окиснення (маркерів окиснення). Таким чином, дійсно можна визначити кількість антиоксиданту в досліджуваному зразку, але упускається дуже важлива інформація про активність антиоксиданту. Ігнорування активності антиоксиданту, у свою чергу, може призводити до суттєвих помилок у визначенні його кількості, наприклад, для "слабких" антиоксидантів, які діють повільно, але протягом тривалого часу.

У цілому нині в області визначення антиоксидантів відсутня стандартизація, що дозволяє порівнювати між собою результати, отримані різними методами.

Хемілюмінесцентний метод є найбільш інформативним методом дослідження антиоксидантів і має ряд істотних переваг:

1. Пряме визначення антиоксидантної дії- Реєструється безпосередня дія антиоксидантів на вільні радикали. У хемілюмінесцентному методі використовується хімічна система генерації вільних радикалів, яка дає контрольне хемілюмінесцентне свічення. Потім до такої системи додається антиоксидант, який нейтралізує вільні радикали, що призводить до пригнічення контрольної хемілюмінесценції.
   Значною перевагою такого підходу є можливість використання різних хімічних систем генерації вільних радикалів, що дозволяє додатково визначати специфічність антиоксидантів та локалізацію їхньої дії.
2. Вимірювання кількісних та якісних характеристик антиоксидантів- хемілюмінесцентний метод дозволяє охарактеризувати будь-яку сполуку, яка має антиоксидантну дію, двома незалежними показниками:
   • Антиоксидантна ємність (АОE)- загальна кількість вільних радикалів, яка може нейтралізувати з'єднання, що міститься у пробі певного обсягу.
   • Антиоксидантна активність (АОА)- Швидкість нейтралізації вільних радикалів, тобто. кількість радикалів, що нейтралізуються в одиницю часу.

Хемілюмінесцентний метод дає важливе розуміння того, що дія антиоксидантів обов'язково має оцінюватися двома показниками – кількісним (AOE) та якісним (AOA).
Наступний малюнок демонструє це положення:

Вплив різних антиоксидантів на хемілюмінесценцію
(цифрами біля графіків вказана концентрація антиоксиданту):
ліворуч - "сильний" антиоксидант, праворуч - "слабкий" антиоксидант.

Антиоксиданти суттєво відрізняються своєю активністю. Існують " сильні " антиоксиданти, тобто. антиоксиданти з високою активністю, які пригнічують вільні радикали з високою швидкістю і повністю пригнічують хемілюмінесценцію. Такі антиоксиданти мають максимальний ефект вже при малих концентраціях і швидко витрачаються. З іншого боку є " слабкі " антиоксиданти, тобто. антиоксиданти з низькою активністю, які пригнічують вільні радикали з низькою швидкістю і пригнічують хемілюмінесценцію лише частково. Значний ефект такі антиоксиданти мають тільки у великих концентраціях, але при цьому вони повільно витрачаються і діють протягом тривалого часу.

Хемілюмінесцентний метод може застосовуватися для визначення антиоксидантних показників:

• біологічних рідин (плазма, слина, сеча);
• фармакологічних препаратів та біологічно активних добавок;
• напоїв та харчових добавок;
• косметичних засобів та засобів для догляду;
• та ін.

Для реалізації хемілюмінесцентного методу визначення антиоксидантів рекомендується використовувати наступне обладнання:

• Хемілюмінометр Lum-100 - забезпечує термостатування та реєстрацію хемілюмінесценції 1 проби.
• Хемілюмінометр Lum-1200 - забезпечує термостатування та одночасну реєстрацію хемілюмінесценції до 12 проб.